AAV 반복 실험 결과 차이가 큰 이유와 생산 변동 원인

AAV(아데노 관련 바이러스, Adeno-Associated Virus) 패키징 실험을 반복하다 보면 동일한 벡터를 사용하더라도 최종 바이러스 수율이나 역가(titer)가 매번 완전히 동일하게 나오지는 않습니다. 세포 상태, 플라스미드 배치, 실험 과정 등에 차이가 있을 경우 생산 배치 간에 어느 정도의 변동이 발생할 수 있습니다.

하지만 반복적인 AAV 패키징에서 바이러스 역가 차이가 지나치게 크거나 이러한 차이가 후속 세포 실험이나 동물 실험에 영향을 줄 정도라면, 생산 과정에서 어떤 요인이 결과에 영향을 주었는지 확인할 필요가 있습니다.

특히 동일한 AAV 샘플을 반복 측정했을 때 결과는 비교적 안정적인데 생산 배치에 따라 AAV 역가가 크게 달라진다면, 우선적으로 AAV 생산 과정에서 발생한 변동을 확인하는 것이 좋습니다. 실제로는 세포 상태, 플라스미드 품질, 형질도입/트랜스펙션 과정, 혈청형 및 벡터 구성, 수확, 정제와 농축 과정 등을 순서대로 살펴볼 수 있습니다.

세포 상태부터 확인해야 하는 이유

AAV 생산에서는 일반적으로 HEK293 계열 세포가 사용되며, 세포의 상태는 바이러스 생산 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 같은 종류의 세포를 사용하더라도 계대배양 이력, 증식 속도, 세포 생존율, 트랜스펙션 시점의 세포 상태 등에 차이가 있을 수 있습니다.

예를 들어 한 배치에서는 세포가 정상적으로 증식하고 있었지만 다른 배치에서는 성장 속도가 떨어지거나 세포 상태가 좋지 않았다면, 동일한 생산 조건을 적용하더라도 최종 AAV 수율에 차이가 발생할 수 있습니다.

따라서 반복 실험을 비교할 때는 단순히 “동일한 세포를 사용했다”는 것만 확인하기보다 세포의 공급원과 배치, 계대 이력, 생산 전 상태, 트랜스펙션 시점의 세포 상태 등을 함께 확인하는 것이 좋습니다.

AAV 패키징 플라스미드의 품질과 배치도 확인

AAV 패키징에는 일반적으로 전달 플라스미드와 Rep/Cap 관련 플라스미드, 보조 기능을 제공하는 구성 요소 등이 사용됩니다. 플라스미드의 농도, 순도, 구조적 무결성 및 배치 차이는 AAV 생산 결과에 영향을 줄 수 있습니다.

특히 AAV 전달 플라스미드에 포함된 ITR(Inverted Terminal Repeat)은 AAV 벡터에서 중요한 역할을 하는 서열이므로 플라스미드 제작 및 증폭 과정에서 그 안정성과 무결성을 확인할 필요가 있습니다.

두 번의 생산 실험 사이에서 플라스미드 배치가 변경되었고 동시에 AAV 수율에도 큰 변화가 나타났다면, 사용한 플라스미드의 품질과 배치를 비교해 보는 것이 좋습니다.

또한 실제 생산에 사용된 DNA 양이 기록값과 일치하는지도 확인해야 합니다. 플라스미드 농도 측정이나 분주 과정에서 발생한 작은 차이가 여러 플라스미드가 함께 사용되는 AAV 생산 시스템에서는 최종 결과에 영향을 줄 수 있습니다.

트랜스펙션 효율이 달라지면 AAV 생산량도 달라질 수 있다

세포와 플라스미드에 특별한 문제가 없다면 다음으로 트랜스펙션 과정을 확인할 수 있습니다.

플라스미드 기반 AAV 생산에서는 DNA가 세포 내로 전달되는 과정이 이후 바이러스 관련 구성 요소의 발현에 영향을 줄 수 있습니다. 특정 배치에서 트랜스펙션 효율이 낮아졌다면 세포 자체의 상태가 크게 나빠 보이지 않더라도 최종 AAV 생산량이 감소할 수 있습니다.

따라서 AAV 생산 변동을 확인할 때 최종 vg/mL만 기록하기보다는, 가능한 경우 트랜스펙션 효율을 확인할 수 있는 적절한 지표를 함께 관리하는 것이 도움이 됩니다.

이를 통해 문제가 트랜스펙션 이전의 세포 또는 플라스미드 단계에서 발생했는지, 아니면 이후의 바이러스 생산 과정에서 발생했는지를 구분하는 데 도움이 될 수 있습니다.

AAV 혈청형과 벡터 구성도 비교해야 한다

AAV 혈청형에 따라 생산 특성이 동일하지 않을 수 있습니다. 따라서 서로 다른 생산 배치를 비교할 때는 동일한 AAV 혈청형을 사용했는지 확인해야 합니다.

또한 혈청형이 동일하더라도 GOI(Gene of Interest), 프로모터, polyA 및 기타 주요 벡터 구성 요소가 변경되었다면 두 실험을 완전히 동일한 조건으로 보기는 어렵습니다.

일부 GOI 또는 복잡한 발현 카세트는 세포 상태나 바이러스 생산에 영향을 줄 가능성이 있습니다. 따라서 벡터를 변경한 후 생산량에 변화가 발생했다면 패키징 조건뿐만 아니라 벡터 자체의 구조도 함께 검토해야 합니다.

수확 단계의 결과를 비교하면 문제 발생 위치를 좁힐 수 있다

세포 상태, 플라스미드 및 트랜스펙션 과정에 뚜렷한 차이가 없는데 최종 AAV 역가가 크게 달라진다면, 각 생산 배치의 수확 단계 샘플을 비교하는 것이 도움이 됩니다.

수확 단계부터 이미 AAV 농도 또는 관련 지표에 차이가 있다면 상류 생산 과정에서 변동이 발생했을 가능성이 높습니다.

반대로 수확 단계에서는 결과가 비슷했지만 정제와 농축을 거친 후 차이가 크게 벌어진다면, 정제 및 회수 과정에서의 손실을 확인해야 합니다.

따라서 최종 제품의 vg/mL만 비교하기보다는 가능하다면 생산 과정의 주요 중간 단계 데이터를 함께 비교하는 것이 좋습니다.

정제와 농축 과정에서도 AAV 회수율이 달라질 수 있다

AAV는 수확 후 바로 최종 제품이 되는 것이 아니라 일반적으로 여러 하류 공정을 거치게 됩니다. 이 과정에서 발생하는 바이러스 손실이나 회수율의 차이는 최종 제품의 역가에 영향을 줄 수 있습니다.

예를 들어 두 배치의 수확 단계에서는 AAV 수준이 비슷했지만 정제 후 한 배치의 역가가 크게 감소했다면, 세포 배양이나 트랜스펙션 조건을 다시 조정하기보다는 정제 및 농축 과정에서의 회수율을 확인하는 것이 더 적절합니다.

따라서 AAV 생산 기록을 관리할 때 최종 제품의 역가뿐 아니라 가능하다면 주요 공정 단계의 샘플 결과도 함께 기록해 두는 것이 좋습니다.

vg/mL 하나만으로 AAV 생산 안정성을 판단해서는 안 된다

AAV의 유전체 역가는 일반적으로 vg/mL와 같은 단위로 표시하며, 바이러스 생산 결과를 평가하는 중요한 지표입니다. 하지만 vg/mL 하나만으로 AAV 샘플의 전체적인 품질을 판단할 수는 없습니다.

두 배치의 vg/mL가 크게 다르다면 필요에 따라 AAV 유전체 무결성, 캡시드 관련 지표, empty/full particle 관련 지표, 순도 및 기능적 활성 등의 결과를 함께 비교하는 것이 좋습니다.

예를 들어 두 배치의 vg/mL가 비슷하더라도 기능적 활성이 다를 수 있고, 반대로 vg/mL는 차이가 있지만 다른 품질 지표에서는 큰 차이가 없을 수도 있습니다. 이러한 경우에는 원인을 동일하게 판단해서는 안 됩니다.

AAV 패키징 배치 간 차이가 클 때의 권장 확인 순서

실제 실험에서는 다음과 같은 순서로 확인하면 원인을 좁히는 데 도움이 됩니다.

세포 상태 → 플라스미드 품질 및 배치 → 트랜스펙션 효율 → 혈청형 및 벡터 구성 → 수확 단계 → 정제/농축 회수율 → AAV 품질 지표

특히 세포 상태, 플라스미드 품질 및 트랜스펙션 과정은 비교적 앞 단계에 위치하기 때문에 우선 확인할 가치가 있습니다.

가능하다면 여러 조건을 한 번에 변경하기보다는 주요 변수를 하나씩 확인하는 것이 좋습니다. 여러 조건을 동시에 변경하면 생산량이 다시 증가하더라도 어떤 요인이 실제 원인이었는지 판단하기 어려워집니다.

정리

AAV 반복 패키징에서 배치 간 결과 차이가 크게 나타난다면 먼저 그 차이가 실제 생산 변동인지 확인해야 합니다. 동일한 AAV 샘플의 반복 측정 결과가 안정적인데 서로 다른 생산 배치에서만 역가 차이가 크게 나타난다면 생산 과정에 초점을 맞춰 확인하는 것이 적절합니다.

실제적으로는 세포 상태, 플라스미드 품질 및 배치, 트랜스펙션 과정을 우선적으로 확인하고, 상류 과정에 뚜렷한 문제가 없다면 수확 및 정제·농축 단계의 회수율까지 범위를 넓혀볼 수 있습니다.

AAV 생산을 반복적으로 수행하는 경우에는 매번 최종 vg/mL만 비교하기보다 세포, 플라스미드, 트랜스펙션, 수확 및 QC 데이터를 함께 기록하는 것이 좋습니다. 여러 배치의 데이터를 축적하면 AAV 생산 변동에 영향을 주는 요인을 파악하고 배치 간 일관성을 높이는 데 도움이 됩니다.