AAV 반복 실험 결과 차이가 큰 이유와 검출 변동 원인

AAV 패키징이 끝난 후에는 qPCR 또는 ddPCR 등을 이용해 바이러스 유전체 역가를 확인하는 경우가 많습니다. 그런데 생산 과정에는 특별한 변화가 없었는데 반복 측정 결과가 크게 달라지는 경우가 있습니다.

이런 상황에서는 AAV 생산 자체에 문제가 있다고 바로 판단하기보다 검출 과정에서 변동이 발생했는지 먼저 확인할 필요가 있습니다.

AAV 역가 측정에는 샘플 혼합과 희석, 바이러스 샘플 전처리, 핵산 처리, PCR 반응 및 결과 계산 등 여러 단계가 포함됩니다. 어느 한 단계에서 반복성이 떨어지면 최종적인 vg/mL 결과에도 차이가 나타날 수 있습니다.

따라서 AAV 반복 실험 결과를 평가할 때는 서로 다른 생산 배치 간 차이와 동일한 샘플을 반복 측정했을 때의 차이를 구분해서 보는 것이 중요합니다.

동일한 AAV 샘플의 반복 측정부터 확인

검출 변동 여부를 판단하는 가장 간단한 방법은 동일한 AAV 샘플을 반복 측정하는 것입니다.

같은 샘플을 동일한 조건에서 반복 측정했을 때 결과가 비교적 일정하다면 검출 시스템 자체의 반복성은 어느 정도 확보되어 있다고 볼 수 있습니다. 이 경우 생산 배치 간 차이를 별도로 확인해야 합니다.

반대로 동일한 AAV 샘플을 반복 측정했는데도 결과가 크게 달라진다면 생산 조건을 다시 조정하기 전에 검출 과정부터 확인하는 것이 좋습니다.

즉,

동일 샘플의 반복 측정 결과가 불안정하다면 검출 과정을 우선 확인하고, 동일 샘플은 안정적으로 측정되지만 생산 배치 간 결과가 다르다면 생산 과정을 확인하는 방식으로 접근할 수 있습니다.

샘플 혼합과 희석 과정 확인

AAV 역가를 측정할 때는 원액을 일정한 배수로 희석해 사용하는 경우가 많습니다. 이 과정에서 샘플 혼합이 충분하지 않거나 희석 과정에서 오차가 발생하면 최종 결과에 영향을 줄 수 있습니다.

확인해야 할 사항은 다음과 같습니다.

• 원액 샘플이 충분히 균질하게 혼합되었는지
• 희석 배수가 정확했는지
• 반복 샘플 간 동일한 방식으로 처리했는지
• 피펫팅 과정에서 오차가 발생하지 않았는지
• 희석한 샘플을 적절한 조건에서 사용했는지

검출 결과가 이상할 때는 PCR 자체만 의심하기보다 그 이전의 샘플 처리 과정을 먼저 확인하는 것이 효율적입니다.

핵산 처리 과정도 결과에 영향을 줄 수 있다

qPCR이나 ddPCR을 이용한 AAV 유전체 역가 측정에서는 바이러스 샘플의 전처리와 핵산 처리가 중요한 부분입니다.

반복 샘플마다 핵산이 검출 가능한 형태로 전환되는 과정에 차이가 발생하면 실제 AAV 양이 동일하더라도 측정값이 달라질 수 있습니다.

따라서 검출 과정을

샘플 전처리 → 핵산 주형 준비 → qPCR/ddPCR

로 나누어 확인하는 것이 좋습니다.

주형 준비 단계에서 이미 반복성이 떨어진다면 PCR 조건만 변경해서는 문제를 해결하기 어렵습니다.

qPCR과 ddPCR 검출 시스템 자체도 확인해야 한다

샘플 처리에 특별한 문제가 없다면 PCR 검출 시스템을 확인해야 합니다.

qPCR에서는 표준물질, 표준곡선, primer와 probe, 증폭 효율, 기술적 반복 결과 등을 확인할 필요가 있습니다.

ddPCR에서는 전통적인 qPCR 표준곡선과는 다른 방식으로 정량하지만, 반응 상태와 droplet 품질, 양성 및 음성 신호의 분리 상태 등은 확인해야 합니다.

특정 반복 웰 하나에서만 비정상적인 결과가 나타나고 나머지 반복은 비슷하다면 AAV 샘플 자체의 문제보다 피펫팅, 분주 또는 해당 반응의 국소적인 이상 가능성을 먼저 검토할 수 있습니다.

qPCR에서는 표준물질과 계산 방식도 중요하다

qPCR로 AAV 역가를 정량할 경우 표준물질의 품질과 정량값은 최종 결과에 직접적인 영향을 줍니다.

서로 다른 실험에서 표준물질의 종류나 준비 방법이 달라졌다면, 동일한 AAV 샘플을 사용하지 않는 한 실험 간 결과를 단순 비교하기 어려울 수 있습니다.

또한 표준곡선의 상태, 샘플 희석 배수 및 최종 계산 방법이 동일한지도 확인해야 합니다.

장기간 AAV 역가를 측정하는 경우에는 가능한 한 검출법과 계산 기준을 일정하게 유지하는 것이 배치 간 결과를 비교하는 데 도움이 됩니다.

검출 타깃이 AAV 벡터 구조와 맞는지 확인

AAV 유전체 역가 측정에서는 벡터 내 특정 서열을 대상으로 primer 또는 probe를 설계합니다.

따라서 GOI나 발현 카세트 등 벡터 구성이 달라졌다면 기존 검출법이 해당 벡터에도 적절한지 다시 확인할 필요가 있습니다.

특히 서로 다른 AAV 벡터를 비교할 때 동일한 primer와 검출 조건을 사용한다고 해서 항상 동일한 수준의 비교 가능성이 확보되는 것은 아닙니다.

검출 타깃의 위치와 서열 특성, 벡터 구조 등을 함께 고려해야 합니다.

PCR 억제 가능성도 확인할 필요가 있다

AAV 샘플의 전처리 과정에서 PCR 반응에 영향을 줄 수 있는 물질이 충분히 제거되지 않았다면 증폭 효율이 낮아지거나 검출 결과의 반복성이 떨어질 수 있습니다.

예를 들어 동일한 샘플을 여러 번 측정했을 때 결과가 크게 달라지고, 적절한 희석 후 결과가 오히려 안정되는 양상이 관찰된다면 PCR 억제 가능성을 검토할 수 있습니다.

다만 이러한 현상만으로 PCR 억제가 발생했다고 단정해서는 안 되며, 해당 검출법의 조건과 실험 데이터를 함께 확인해야 합니다.

기술적 반복과 생산 배치 반복은 구분해야 한다

AAV 실험에서 말하는 “반복 실험”에는 서로 다른 의미가 있을 수 있습니다.

동일한 AAV 샘플을 여러 번 측정하는 것은 주로 검출법의 반복성을 확인하기 위한 기술적 반복입니다.

반면 AAV 패키징을 독립적으로 여러 번 수행하는 것은 생산 공정의 배치 간 일관성을 평가하기 위한 반복입니다.

두 가지를 같은 기준으로 판단하면 원인을 잘못 해석할 수 있습니다.

검출법 자체의 반복성이 확보되지 않은 상태에서 생산 배치 간 차이를 비교하면 실제 생산 차이보다 검출 오차가 크게 나타날 가능성도 있습니다.

AAV 역가 하나만으로 이상 여부를 판단하지 않는 것이 좋다

AAV 품질을 평가할 때는 vg/mL 하나만으로 모든 결과를 판단하기 어렵습니다.

특정 배치의 유전체 역가가 예상보다 높거나 낮게 나타났다면 필요에 따라 유전체 무결성, 캡시드 관련 지표, empty/full particle 관련 지표, 순도 및 기능적 활성 등의 결과를 함께 비교할 수 있습니다.

만약 특정 qPCR 또는 ddPCR 결과만 이상하고 다른 품질 지표나 실험 결과가 크게 변하지 않았다면 검출 과정의 문제를 우선적으로 확인할 필요가 있습니다.

반대로 여러 독립적인 QC 지표에서 동일한 방향의 변화가 나타난다면 실제 AAV 생산 또는 제품 품질의 변화 가능성도 함께 검토해야 합니다.

AAV 검출 결과가 크게 달라질 때의 확인 순서

검출 과정에서 발생하는 변동은 다음 순서로 확인하는 것이 비교적 효율적입니다.

동일 샘플의 반복성 → 샘플 혼합 및 희석 → 핵산 처리 → qPCR/ddPCR 반응 → 표준물질 및 계산 방법 → primer/probe 및 검출 타깃 → PCR 억제 가능성 → 검출법 자체

앞 단계에서 문제가 확인되면 뒤쪽의 조건을 불필요하게 변경하지 않아도 됩니다.

특히 동일한 AAV 샘플을 반복 측정했을 때 결과가 안정적으로 나오지 않는다면, AAV를 다시 생산하기 전에 검출 시스템의 반복성을 먼저 확인하는 것이 좋습니다.

정리

AAV 반복 실험 결과의 차이가 크다고 해서 항상 AAV 패키징 과정에 문제가 있는 것은 아닙니다. 동일한 AAV 샘플을 반복 측정했을 때부터 결과가 크게 달라진다면 검출 과정에서 발생한 변동을 우선적으로 확인해야 합니다.

실제 배치에서는 샘플 혼합과 희석, 핵산 처리, qPCR/ddPCR 반응, 표준물질, 검출 타깃 및 PCR 억제 가능성 등을 차례로 확인할 수 있습니다.

AAV 생산 배치의 일관성을 평가하려면 먼저 검출법 자체의 반복성이 확보되어 있어야 합니다. 그래야 실제 생산 공정에서 발생한 차이와 단순한 검출 오차를 구분할 수 있습니다.

결국 AAV 반복 실험의 결과를 제대로 비교하려면 최종 vg/mL만 보는 것보다 생산 과정과 검출 과정을 분리해서 평가하는 것이 중요합니다. 이를 통해 불필요한 생산 조건 변경을 줄이고, 실제로 개선이 필요한 공정을 보다 정확하게 찾을 수 있습니다.