AAV 정제 후 역가가 감소하는 이유는?

AAV(아데노연관바이러스, Adeno-Associated Virus)를 생산한 후에는 일반적으로 수확, 정제, 농축 및 완충액 교환 등의 과정을 거쳐 최종 제품을 확보합니다. 이 과정에서 자주 발생하는 문제 중 하나가 AAV 정제 전보다 정제 후 바이러스 역가가 낮아지는 현상입니다.

특히 qPCR이나 ddPCR로 AAV 유전체 역가를 측정했을 때 정제 전에는 높은 vg/mL가 확인되었지만, 정제와 농축을 거친 후 vg/mL가 예상보다 크게 감소하는 경우가 있습니다.

이러한 결과가 반드시 AAV 패키징에 문제가 있었다는 의미는 아닙니다. AAV 정제 과정에서는 바이러스 입자의 일부가 각 공정에서 손실될 수 있으며, 정제 전후의 샘플 부피와 조성도 달라지기 때문입니다.

따라서 AAV 정제 후 역가가 감소했다는 사실만으로 바이러스가 실제로 동일한 비율로 손실되었다고 판단해서는 안 됩니다. 정제 전후의 총 바이러스 양과 각 단계의 회수율을 함께 확인해야 실제 원인을 보다 정확하게 파악할 수 있습니다.

AAV 정제 후 역가가 감소하는 주요 원인

AAV 정제는 하나의 작업으로 끝나는 것이 아니라 여러 단계로 이루어집니다. 각 단계에서 일정 수준의 제품 손실이 발생할 수 있으며, 여러 단계가 누적되면서 최종 회수율에 영향을 줄 수 있습니다.

1. 정제 과정에서 AAV가 일부 손실될 수 있습니다

AAV 정제에서는 일반적으로 원액의 전처리 및 정제, 농축, 완충액 교환 등의 과정이 이루어집니다.

예를 들어 크로마토그래피를 이용하는 경우 AAV가 정제용 레진에 충분히 결합하지 못해 flow-through로 빠져나가거나, 세척 과정에서 일부 손실될 수 있습니다. 반대로 AAV가 레진에 지나치게 강하게 결합하면 용출 과정에서 완전히 회수되지 않을 수도 있습니다.

따라서 정제 전후의 역가 차이를 확인할 때는 최종 제품만 보는 것보다 각 단계에서 얼마나 많은 AAV가 회수되었는지를 확인하는 것이 중요합니다.

2. AAV 혈청형에 따라 정제 회수율이 달라질 수 있습니다

AAV는 혈청형에 따라 캡시드 단백질의 특성이 다릅니다. 캡시드의 표면 특성과 전하 특성 등이 달라지기 때문에 특정 정제 레진과의 상호작용 역시 동일하지 않을 수 있습니다.

예를 들어 특정 혈청형에 적합한 크로마토그래피 조건이 다른 혈청형에서는 동일한 수준의 결합 및 용출 효율을 나타내지 않을 수 있습니다.

따라서 AAV 혈청형이 달라졌는데도 동일한 정제 조건을 그대로 적용하면 최종 AAV 회수율에 차이가 발생할 수 있습니다.

이는 AAV 정제 공정을 개발할 때 혈청형별 특성을 함께 고려해야 하는 이유 중 하나입니다.

3. 크로마토그래피 조건이 적절하지 않을 수 있습니다

AAV 정제에서 크로마토그래피 조건은 바이러스 회수율에 직접적인 영향을 줄 수 있습니다.

레진과 AAV의 결합은 pH, 이온강도 및 바이러스 캡시드의 특성 등에 영향을 받을 수 있습니다. 조건이 적절하지 않으면 AAV가 레진에 충분히 결합하지 않거나, 원하는 조건에서 효과적으로 용출되지 않을 수 있습니다.

따라서 정제 후 역가가 크게 감소했다면 단순히 “AAV가 정제 과정에서 파괴되었다”고 판단하기보다는 flow-through와 세척액, 용출액 등을 함께 분석해 AAV가 어느 단계에 남아 있는지 확인하는 것이 좋습니다.

4. 초여과 및 완충액 교환 과정에서 AAV가 손실될 수 있습니다

크로마토그래피가 끝난 후에는 AAV를 원하는 농도로 맞추거나 최종 제형에 적합한 완충액으로 변경하기 위해 초여과/완충액 교환(UF/DF)을 사용하는 경우가 많습니다.

이 과정에서도 일정량의 AAV가 손실될 수 있습니다.

AAV가 필터 막이나 장비 내부 표면에 비특이적으로 흡착될 수 있고, 일부 바이러스가 시스템 내부에 잔류할 수도 있습니다. 특히 시료의 농도가 낮거나 처리량이 적은 경우 이러한 손실이 최종 회수율에 상대적으로 큰 영향을 줄 수 있습니다.

따라서 크로마토그래피 후 AAV 역가는 정상인데 UF/DF 이후 역가가 크게 감소했다면 초여과막과 공정 조건, 장비 시스템 등을 별도로 확인할 필요가 있습니다.

5. AAV가 튜브, 필터 또는 용기에 흡착될 수 있습니다

AAV 정제 과정에서는 다양한 재질의 튜브, 필터, 크로마토그래피 컬럼 및 보관 용기와 접촉하게 됩니다.

이 과정에서 AAV 입자가 이러한 표면에 비특이적으로 흡착되면 일부 제품이 회수되지 않을 수 있습니다.

일반적으로 고농도 시료에서는 이러한 손실의 영향이 상대적으로 작게 나타날 수 있지만, 저농도 AAV에서는 작은 양의 흡착도 최종 역가에 영향을 줄 수 있습니다.

따라서 AAV 정제 수율을 평가할 때는 정제 컬럼이나 필터 자체뿐만 아니라 바이러스가 이동하는 전체 경로를 함께 고려하는 것이 좋습니다.

6. 정제 조건이 AAV의 안정성에 영향을 줄 수 있습니다

AAV 캡시드는 비교적 안정적인 구조를 가지고 있지만 모든 환경에서 동일하게 안정한 것은 아닙니다.

pH, 이온강도, 온도, 완충액 조성 및 처리 시간 등에 따라 바이러스 입자의 안정성이 달라질 수 있습니다.

일부 정제 공정에서는 AAV를 레진에서 용출하기 위해 특정 조건을 사용합니다. 이러한 조건이 적절하지 않거나 AAV가 불리한 환경에 장시간 노출되면 입자 응집이나 구조적 변화가 발생할 가능성이 있습니다.

이 경우 문제는 단순한 vg/mL 감소로만 나타나지 않을 수 있습니다. 입자 상태나 순도, 유전체 무결성 또는 기능적 활성에 변화가 함께 나타날 수 있기 때문에 여러 품질 지표를 함께 확인하는 것이 필요합니다.

AAV 정제 후 vg/mL가 감소했다고 해서 실제 바이러스 손실량도 같은 것은 아닙니다

AAV 정제 결과를 해석할 때 가장 주의해야 할 부분 중 하나입니다.

vg/mL는 바이러스 유전체의 농도를 나타내는 값이지, 전체 바이러스의 총량을 나타내는 값은 아닙니다.

예를 들어 정제 전 AAV가 1 × 10¹² vg/mL이고 시료 부피가 10 mL라면 총 바이러스 유전체 양은 약 1 × 10¹³ vg입니다.

정제 후 농도가 5 × 10¹¹ vg/mL로 감소했더라도 최종 부피가 15 mL라면 총 바이러스 유전체 양은 약 7.5 × 10¹² vg입니다.

즉, vg/mL는 50% 감소했지만 총 바이러스 양이 50% 감소한 것은 아닙니다.

반대로 정제 후 AAV를 고농도로 농축하면 vg/mL는 크게 증가할 수 있지만, 실제 총 바이러스 양은 정제 과정에서 일부 손실되었을 수도 있습니다.

따라서 AAV 정제 회수율을 평가할 때는 단순히 정제 전후의 vg/mL만 비교하기보다 다음과 같이 전체 양을 함께 계산하는 것이 적절합니다.

총 바이러스 양 = vg/mL × 시료 부피

이를 바탕으로 각 단계의 회수율을 확인하면 AAV가 실제로 얼마나 손실되었는지 보다 정확하게 판단할 수 있습니다.

정제 과정에서 불순물이 제거되면서 측정값이 달라질 수도 있습니다

AAV 상류 수확액에는 목표 AAV 외에도 숙주세포 단백질, 숙주세포 DNA, 배양 성분 및 다양한 형태의 바이러스 입자가 포함될 수 있습니다.

예를 들어 완전한 유전체를 포함하지 않는 empty capsid와 기타 비정상적인 입자가 존재할 수 있습니다.

AAV 정제의 중요한 목적 중 하나는 이러한 불순물과 원하지 않는 입자를 제거하고 목표 제품의 품질을 높이는 것입니다.

따라서 정제 전후의 시료 구성은 당연히 달라질 수 있습니다. 이때 사용하는 분석법이나 시료 전처리 조건에 따라 정제 전후 측정값의 차이가 나타날 수 있습니다.

따라서 “정제 후 역가가 감소했다”는 결과만으로 제품이 동일한 비율로 손실되었다고 판단하기보다는 vg/mL, 총 vg, 캡시드 입자 수, empty capsid 비율, 순도 및 유전체 무결성 등을 함께 비교하는 것이 좋습니다.

AAV 역가 측정 방법도 확인해야 합니다

AAV 유전체 역가는 일반적으로 qPCR 또는 ddPCR을 이용해 측정합니다.

정제 전후 시료는 완충액 조성, 염 농도, 단백질 함량 및 시료 농도 등이 달라질 수 있습니다. 이러한 차이가 시료 전처리와 분석 결과에 영향을 줄 가능성도 있습니다.

따라서 AAV 정제 전후의 역가를 비교할 때는 가능하면 동일한 분석법과 일관된 시료 처리 방법을 적용하고, 표준물질과 희석 조건, 계산 방법도 함께 확인하는 것이 좋습니다.

특히 정제 전에는 qPCR을 사용하고 정제 후에는 다른 분석법을 사용하는 것처럼 측정 조건이 달라진다면, 두 결과를 단순 비교하기 어려울 수 있습니다.

AAV가 어느 단계에서 손실되었는지 확인하는 방법

AAV 정제 전후 두 개의 시료만 비교하면 실제 손실이 발생한 위치를 찾기가 어렵습니다.

보다 정확하게 확인하려면 전체 정제 공정을 단계별로 나누어 분석하는 것이 좋습니다.

예를 들어 다음과 같이 주요 중간 시료를 확인할 수 있습니다.

수확액 → 전처리/정제 전 시료 → 크로마토그래피 flow-through → 세척액 → 용출액 → UF/DF 전 시료 → 최종 제제

각 단계의 AAV 함량을 비교하면 어느 공정에서 손실이 많이 발생했는지 파악할 수 있습니다.

만약 flow-through에서 높은 AAV 신호가 확인된다면 캡처 단계에서 AAV가 충분히 결합하지 않았을 가능성을 검토할 수 있습니다.

반대로 용출 후에도 컬럼이나 시스템에 AAV가 많이 남아 있다면 용출 조건이나 회수 범위를 확인할 필요가 있습니다.

크로마토그래피 회수율은 정상인데 UF/DF 이후 AAV가 크게 감소했다면 필터막, 장비 및 농축·완충액 교환 조건을 중심으로 확인하는 것이 효율적입니다.

AAV 정제 후 역가가 감소했을 때 무엇을 확인해야 할까?

AAV 정제 후 역가가 예상보다 낮다면 다음과 같은 순서로 확인하는 것이 좋습니다.

먼저 정제 전후의 시료 부피와 총 바이러스 양을 비교합니다. vg/mL만 비교하면 실제 손실량을 잘못 판단할 수 있기 때문입니다.

그다음 각 정제 단계의 회수율을 확인합니다. 가능하다면 flow-through, 세척액, 용출액 등 주요 중간 시료를 분석해 AAV가 어느 단계에서 빠져나갔는지 확인합니다.

이후 사용하는 AAV 혈청형에 현재 정제 조건이 적합한지 확인하고, 크로마토그래피와 UF/DF 과정에서 제품 손실이 발생하지 않았는지 살펴볼 수 있습니다.

마지막으로 정제 전후의 순도, empty capsid 비율, 유전체 무결성 및 기능적 활성을 비교하면 단순한 농도 변화인지 실제 제품 품질 저하가 발생한 것인지 판단하는 데 도움이 됩니다.

마무리

AAV 정제 후 바이러스 역가가 감소하는 것은 비교적 흔하게 발생할 수 있는 현상입니다. 크로마토그래피에서의 결합 및 용출 손실, 초여과와 완충액 교환 과정의 손실, 필터나 용기 표면에 대한 흡착, 부적절한 정제 조건에 따른 입자 안정성 변화 등이 원인이 될 수 있습니다.

또한 정제 전후의 시료 부피가 달라지면 vg/mL 역시 달라질 수 있기 때문에, AAV 정제 후 vg/mL가 감소했다는 사실만으로 실제 바이러스 손실을 판단해서는 안 됩니다.

AAV 정제 공정의 성능을 평가할 때는 vg/mL뿐만 아니라 총 vg, 단계별 회수율, 캡시드 입자 수, empty capsid 비율, 순도, 유전체 무결성 및 기능적 활성을 함께 확인하는 것이 중요합니다.

결국 AAV 정제에서 중요한 것은 정제 후 역가를 무조건 높게 유지하는 것만이 아니라, 어느 단계에서 AAV가 손실되는지 확인하고, 필요한 순도와 품질을 유지하면서 가능한 높은 회수율을 확보하는 것입니다.