AAV 혈청형에 따라 생산량이 다른 이유는? AAV 패키징 생산량에 영향을 미치는 주요 요인

AAV(아데노연관바이러스, Adeno-Associated Virus)를 패키징할 때 동일한 생산 세포와 유사한 플라스미드, 비슷한 생산 조건을 사용하더라도 혈청형에 따라 최종 바이러스 생산량이 다르게 나타나는 경우가 있습니다.

예를 들어, HEK293 세포를 이용해 AAV를 생산하더라도 혈청형에 따라 최종적으로 측정되는 vg/mL에 차이가 발생할 수 있습니다. 이러한 차이가 반드시 패키징 과정에 문제가 있다는 의미는 아닙니다. AAV 혈청형마다 캡시드 단백질(Cap)의 특성이 다르며, 이러한 차이가 바이러스 캡시드 형성, 유전체 패키징 및 이후 정제 과정에 영향을 줄 수 있기 때문입니다.

따라서 AAV 생산량은 특정 한 가지 요인으로 결정되는 것이 아니라 혈청형, 플라스미드 품질, ITR의 무결성, GOI 크기, 생산 세포 상태, 형질주입 효율, 배양 및 수확 조건, 정제 회수율 등 여러 요인이 함께 작용한 결과로 보는 것이 적절합니다.

AAV 혈청형에 따라 생산량이 다른 이유는 무엇인가?

AAV 혈청형의 주요 차이점 중 하나는 캡시드 단백질(Cap)의 서열입니다. Cap 단백질은 AAV의 혈청형과 조직 친화성에 관여할 뿐만 아니라 바이러스 입자의 형성에도 중요한 역할을 합니다.

AAV 생산 과정에서는 생산 세포에서 Cap 단백질이 발현된 후 적절하게 조립되어 바이러스 캡시드를 형성해야 합니다. 혈청형에 따라 Cap 단백질의 발현 수준, 안정성, 조립 특성 등이 다를 수 있기 때문에 동일한 생산 시스템을 사용하더라도 바이러스 생산량이 동일하게 나타나지 않을 수 있습니다.

즉,

혈청형 차이 → Cap 단백질 특성 차이 → 캡시드 형성 및 조립 특성 차이 → 최종 생산량 차이

로 이어질 수 있습니다.

다만 특정 혈청형이 모든 생산 플랫폼에서 항상 더 높은 수율을 보인다고 단정할 수는 없습니다. 실제 생산 결과는 사용하는 세포, 플라스미드 구성, 생산 방식 및 공정 조건에 따라 달라질 수 있습니다.

캡시드 조립 효율도 영향을 미칩니다

Cap 단백질이 정상적으로 발현된다고 해서 많은 양의 완전한 AAV 입자가 자동으로 만들어지는 것은 아닙니다. Cap 단백질은 적절한 구조로 조립되어야 하며, 이 과정의 효율은 혈청형에 따라 달라질 수 있습니다.

특정 생산 조건에서 일부 혈청형은 캡시드 조립이 상대적으로 효율적으로 이루어질 수 있지만, 다른 혈청형에서는 동일한 조건이 최적의 생산 조건이 아닐 수 있습니다.

또한 AAV 생산 과정에서는 유전체가 들어 있지 않은 빈 캡시드(empty capsid)가 함께 생성될 수 있습니다. 따라서 캡시드 입자가 많이 검출된다고 해서 반드시 완전한 AAV 유전체를 가진 바이러스 입자가 많이 생산되었다고 볼 수는 없습니다.

바이러스 유전체 패키징 효율도 중요합니다

AAV 생산량을 평가할 때는 캡시드가 얼마나 많이 만들어졌는지뿐만 아니라, 목표 AAV 유전체가 캡시드 내부에 얼마나 효율적으로 패키징되는지도 중요합니다.

예를 들어 캡시드 형성 자체는 정상적으로 이루어졌지만 유전체 패키징이 충분하지 않다면, 캡시드 관련 분석 결과와 비교했을 때 qPCR 또는 ddPCR로 측정한 vg/mL가 상대적으로 낮게 나타날 수 있습니다.

따라서 AAV 생산을 평가할 때는 다음 지표를 구분해서 보는 것이 필요합니다.

• 캡시드 입자 수
• 바이러스 유전체 역가(vg/mL)
• 유전체 무결성
• 빈 캡시드 비율
• 기능적 활성을 나타내는 지표

이러한 지표는 각각 AAV 제품의 서로 다른 특성을 반영합니다.

AAV 패키징 생산량에 영향을 미치는 주요 요인

혈청형 외에도 AAV 생산 과정의 여러 단계가 최종 생산량에 영향을 줄 수 있습니다.

플라스미드 설계와 품질

AAV 생산에는 일반적으로 목표 유전체를 포함하는 transfer plasmid와 Rep/Cap 관련 구성 요소, helper 기능을 제공하는 구성 요소 등이 사용됩니다. Transfer plasmid에 포함된 GOI와 프로모터 및 기타 조절 요소는 최종적으로 패키징되는 AAV 유전체를 구성합니다.

AAV는 패키징할 수 있는 유전체 크기에 제한이 있기 때문에 발현 카세트가 지나치게 길 경우 유전체 패키징의 효율이나 무결성에 영향을 줄 수 있습니다. 특히 AAV 패키징 용량에 가까운 설계를 사용할 경우에는 단순한 vg/mL뿐 아니라 실제 유전체의 무결성도 함께 확인하는 것이 중요합니다.

ITR 역시 중요한 요소입니다. ITR은 AAV 유전체 복제와 패키징에 필요한 핵심 cis-acting element이므로, 플라스미드 증폭이나 보관 과정에서 ITR의 결실 또는 재배열이 발생하면 AAV 생산에 영향을 줄 수 있습니다.

생산 세포의 상태

AAV 생산에서는 생산 세포의 상태가 전체 공정에 큰 영향을 미칩니다.

세포 생존율이 낮거나 성장 상태가 좋지 않은 경우 형질주입 효율과 바이러스 생산 효율이 함께 떨어질 수 있습니다. 세포의 계대 상태, 세포 밀도, 배양 조건 등도 생산 결과에 영향을 줄 수 있습니다.

특히 이전 배치와 동일한 플라스미드와 생산 조건을 사용했는데 특정 배치에서만 AAV 역가가 크게 낮아졌다면, 플라스미드뿐만 아니라 생산 세포의 상태도 함께 확인할 필요가 있습니다.

형질주입 효율과 패키징 시스템

플라스미드 기반 AAV 생산에서는 생산 세포가 필요한 유전적 구성 요소를 충분히 전달받는 것이 중요합니다.

Transfer plasmid, Rep/Cap 관련 플라스미드 및 helper 기능을 제공하는 구성 요소 사이의 균형이 적절하지 않으면 AAV 생성 과정이 영향을 받을 수 있습니다.

따라서 AAV 역가가 낮아졌을 때 단순히 “바이러스가 잘 패키징되지 않았다”고 판단하기보다는 형질주입 효율과 세포 상태, 플라스미드 품질 및 생산 시스템을 함께 확인하는 것이 좋습니다.

배양 및 수확 조건

AAV 생산은 일정한 시간 동안 진행되는 과정이기 때문에 수확 시점도 생산량에 영향을 줄 수 있습니다.

너무 이른 시점에 수확하면 바이러스가 충분히 축적되지 않았을 수 있고, 반대로 지나치게 늦어 세포 상태가 크게 악화되면 바이러스 회수 및 제품 품질에 영향을 줄 가능성이 있습니다.

따라서 모든 AAV 혈청형에 동일한 수확 조건을 적용하기보다는 사용하는 생산 시스템과 혈청형에 맞는 조건을 설정하는 것이 중요합니다.

바이러스 회수 및 정제 과정

AAV 생산이 끝난 후에는 수확, 바이러스 회수, 정제 및 농축 등의 과정이 이어집니다. 최종 제품의 생산량은 상류 공정에서 얼마나 많은 AAV가 생성되었는지뿐만 아니라 이후 공정에서 얼마나 효율적으로 회수되었는지에 따라서도 달라집니다.

AAV 혈청형마다 캡시드의 물리화학적 특성이 다르기 때문에 밀도 구배 원심분리, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 정제 과정에서 회수율 차이가 발생할 수 있습니다.

따라서 상류 생산량은 비슷하지만 정제 후 최종 AAV 생산량에서 차이가 나타나는 경우도 있습니다.

AAV 생산량이 낮을 때는 어떻게 확인해야 할까?

특정 AAV 혈청형의 생산량이 예상보다 낮다면 혈청형 자체를 원인으로 단정하기보다는 생산 과정의 각 단계를 순서대로 확인하는 것이 좋습니다.

먼저 transfer plasmid의 구조와 ITR 무결성을 확인하고, GOI 및 전체 발현 카세트의 크기가 적절한지 살펴볼 필요가 있습니다. 플라스미드에 문제가 없다면 생산 세포의 상태와 형질주입 효율을 확인하는 것이 다음 단계입니다.

이러한 조건이 모두 정상인데도 특정 혈청형에서 지속적으로 낮은 생산량이 나타난다면 Cap 단백질의 발현 및 캡시드 조립, 유전체 패키징 등의 특성을 고려할 수 있습니다.

또한 상류 생산과 하류 정제 과정을 구분해서 보는 것도 중요합니다. 정제 전 샘플의 역가는 정상인데 정제 후 역가가 크게 감소했다면, AAV 생성 자체보다는 정제 및 회수 과정에서의 손실 가능성을 우선적으로 확인할 수 있습니다.

vg/mL만으로 AAV 생산량을 판단해도 될까?

vg/mL는 AAV 생산에서 가장 널리 사용되는 지표 중 하나이지만, 이 수치만으로 제품의 전체적인 품질이나 기능을 판단하기에는 한계가 있습니다.

vg/mL는 시료에 존재하는 측정 가능한 바이러스 유전체의 양을 나타내는 지표입니다. 따라서 낮은 vg/mL가 반드시 캡시드 생성 자체가 적다는 것을 의미하는 것은 아닙니다.

필요한 경우 캡시드 입자 수, 빈 캡시드 비율, 유전체 무결성, 순도 및 기능적 활성 등을 함께 평가해야 AAV 생산 상태를 보다 정확하게 판단할 수 있습니다.

예를 들어 캡시드 입자 수는 높지만 vg/mL가 낮다면 유전체 패키징과 관련된 요소를 추가로 확인할 필요가 있습니다. 반대로 vg/mL는 정상인데 세포 실험에서 기대한 수준의 기능적 활성이 나타나지 않는다면 유전체 무결성이나 입자 품질 등 다른 요인을 검토해야 할 수 있습니다.

즉, AAV 생산량, 바이러스 역가, 기능적 활성은 서로 같은 의미의 지표가 아닙니다.

정리

AAV 혈청형에 따라 생산량이 다른 것은 비교적 흔하게 나타날 수 있는 현상입니다. 혈청형마다 Cap 단백질의 특성이 다르기 때문에 캡시드 발현과 조립, 유전체 패키징 및 정제 과정에서 차이가 발생할 수 있습니다.

하지만 AAV 생산량을 혈청형 하나만으로 설명하기는 어렵습니다. 플라스미드 설계 및 품질, ITR 무결성, GOI 크기, 생산 세포 상태, 형질주입 효율, 배양 및 수확 조건, 바이러스 회수 및 정제 공정 등 여러 요인이 함께 영향을 미칩니다.

따라서 AAV 생산량이 낮은 원인을 확인할 때는 단순히 vg/mL 수치만 비교하기보다는 상류 생산 과정과 하류 정제 과정을 나누어 살펴보고, 캡시드 입자, 유전체 역가, 유전체 무결성 및 기능적 활성 등의 결과를 함께 분석하는 것이 보다 정확합니다.