AAV 포장 효율에 영향을 미치는 요인은 무엇일까?

AAV(Adeno-Associated Virus, 아데노연관바이러스)의 생산 과정에서 최종적으로 얻어지는 바이러스 수율은 하나의 요인만으로 결정되지 않습니다. AAV 벡터 설계, 플라스미드 품질, 생산 세포의 상태, 형질주입 효율, 배양 조건, 수확 및 정제 공정 등 여러 요소가 서로 영향을 주면서 최종적인 AAV 생산량을 결정합니다.

또한 AAV 포장 효율이 낮은 것과 최종 AAV 역가가 낮은 것은 반드시 같은 의미는 아닙니다. 바이러스 생산량 자체가 낮을 수도 있지만, 수확이나 정제 과정에서 바이러스 손실이 발생해 최종 역가가 낮아질 수도 있습니다. 따라서 AAV 생산량에 문제가 발생했을 때는 전체 생산 공정을 함께 살펴볼 필요가 있습니다.

1. AAV 벡터 설계

AAV 벡터는 제한된 유전체 크기 안에 프로모터, GOI(Gene of Interest), 조절 서열, PolyA 등의 요소를 구성해야 합니다. 따라서 각 요소의 크기와 전체 벡터 길이는 AAV 포장 효율에 영향을 줄 수 있습니다.

천연 AAV의 유전체는 약 4.7 kb이며, 재조합 AAV(rAAV) 역시 제한된 포장 용량을 가지고 있습니다. 벡터 유전체의 크기가 이 범위에 가까워지거나 이를 초과하면 포장 효율이 낮아지고, 불완전하거나 절단된 유전체가 증가할 가능성이 있습니다.

따라서 AAV 벡터를 설계할 때는 GOI의 크기뿐만 아니라 프로모터, 조절 요소, PolyA 등 모든 구성 요소의 크기를 함께 고려해야 합니다.

특히 크기가 큰 GOI를 AAV로 전달하는 경우에는 특정 요소 하나만 줄이는 방식보다는 전체 벡터 구조와 유전체 크기를 종합적으로 최적화하는 접근이 필요합니다.

2. ITR의 무결성

ITR(Inverted Terminal Repeat)은 AAV 벡터 유전체의 양쪽 말단에 위치하는 중요한 시스 작용 요소로, AAV 유전체의 복제와 포장 과정에 필수적입니다.

ITR은 구조적으로 비교적 복잡하기 때문에 플라스미드 증폭, 보관 및 취급 과정에서 구조적 안정성에 주의해야 합니다. ITR의 결실, 돌연변이 또는 재배열이 발생하면 벡터 유전체의 복제 및 포장에 영향을 미쳐 AAV 생산량이 감소할 수 있습니다.

따라서 AAV 벡터용 플라스미드를 사용할 때는 GOI와 같은 목적 서열뿐만 아니라 ITR의 무결성도 함께 확인하는 것이 중요합니다.

3. 패키징 플라스미드의 품질

일반적인 AAV 생산 시스템에서는 전달 플라스미드(Transfer plasmid), Rep/Cap 플라스미드 및 Helper plasmid 등이 사용됩니다.

플라스미드의 품질이 충분하지 않으면 AAV 벡터 자체의 설계가 적절하더라도 생산 효율이 떨어질 수 있습니다.

플라스미드의 순도와 무결성, 엔도톡신 수준 및 핵심 서열의 정확성 등은 형질주입 효율과 세포 상태에 영향을 줄 수 있습니다. 특히 플라스미드가 심하게 분해되었거나 구조적 이상이 있는 경우에는 정상적인 AAV 생산을 방해할 가능성이 있습니다.

따라서 AAV 생산에 사용되는 플라스미드는 생산 전에 품질과 주요 서열을 확인하는 것이 필요합니다.

4. 생산 세포의 상태

현재 AAV 생산에는 HEK293 및 관련 세포 시스템이 널리 사용됩니다. 생산 세포의 상태는 AAV 생산 효율에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다.

세포 생존율이 낮거나 성장 상태가 불안정하면 플라스미드 형질주입과 이후의 바이러스 생성 과정에 영향을 줄 수 있습니다. 세포 밀도 역시 사용하는 생산 시스템에 적합한 범위에서 관리해야 합니다.

동일한 플라스미드와 생산 공정을 사용했는데 이전보다 AAV 생산량이 갑자기 감소했다면, 벡터 자체뿐만 아니라 세포 상태, 계대배양 상태 및 배양 조건을 함께 확인할 필요가 있습니다.

5. 형질주입 효율

플라스미드 형질주입을 이용하는 AAV 생산 시스템에서는 형질주입 효율도 중요한 요소입니다.

AAV 생산을 위해서는 세포가 벡터 유전체, Rep/Cap 및 필요한 보조 기능을 적절하게 제공받아야 합니다. 플라스미드가 세포 내로 충분히 전달되지 않으면 벡터 유전체의 복제와 바이러스 단백질 발현, 바이러스 입자 형성 등에 영향을 줄 수 있습니다.

따라서 플라스미드 품질, 생산 세포 상태 및 형질주입 시스템은 서로 적절하게 맞아야 합니다. 형질주입 효율이 크게 떨어지면 최종 AAV 생산량 역시 감소할 수 있습니다.

6. Rep/Cap 발현 수준

Rep 단백질은 AAV 유전체 복제 등에 관여하며, Cap 단백질은 바이러스 캡시드를 구성합니다. 따라서 두 단백질은 AAV 생산 시스템에서 중요한 역할을 합니다.

Rep/Cap 발현이 충분하지 않으면 바이러스 생성이 감소할 수 있습니다. 반대로 단순히 발현량을 높이는 것이 항상 생산량 증가로 이어지는 것은 아니며, 과도한 Rep 발현은 생산 세포에 부담을 줄 수 있습니다.

따라서 Rep/Cap 관련 플라스미드의 설계와 발현 수준은 사용하는 AAV 생산 시스템에 맞게 최적화해야 합니다.

7. GOI의 크기와 서열 특성

AAV 포장 효율은 벡터 전체 크기뿐만 아니라 GOI 자체의 특성에도 영향을 받을 수 있습니다.

크기가 큰 유전자 또는 반복 서열이나 구조적으로 복잡한 서열을 포함하는 벡터는 플라스미드 증폭 및 AAV 생산 과정에서 구조적 불안정성이 발생할 가능성이 있습니다.

따라서 동일한 생산 시스템을 사용하더라도 GOI에 따라 AAV 생산량에 차이가 발생할 수 있습니다. 특정 GOI에서만 생산량이 낮게 나타난다면 생산 시스템 전체의 문제로 단정하기보다 벡터 크기와 GOI의 서열 특성을 함께 검토하는 것이 좋습니다.

8. 배양 조건

AAV 생산 과정에서는 세포와 플라스미드뿐만 아니라 배양 환경도 중요합니다.

배지 조성, 온도, pH, 세포 밀도, 영양 상태 및 배양 시간 등은 세포의 성장과 바이러스 생성에 영향을 줄 수 있습니다.

특히 생산 규모가 커지면 소규모 배양에서 사용하던 조건을 그대로 적용하기 어려울 수 있습니다. 생산 규모를 확대할 경우에는 배양 환경과 공정 조건의 일관성을 확보하는 것이 중요합니다.

9. 수확 시점

AAV 생산 과정에서 바이러스는 배양 시간에 따라 세포 내외에 분포하는 양상이 달라질 수 있습니다.

수확 시점이 너무 빠르면 충분한 바이러스가 생성되기 전에 수확하게 될 수 있으며, 반대로 지나치게 늦어질 경우 세포 상태 변화 등이 최종 회수량에 영향을 줄 수 있습니다.

따라서 AAV 수확 시점은 특정한 하나의 시간으로 일괄 적용하기보다는 사용하는 세포 시스템, 벡터 및 생산 공정에 따라 적절한 수확 시점을 평가하는 것이 필요합니다.

10. AAV 정제 및 회수 공정

AAV 생산 과정에서 한 가지 중요한 점은 세포에서 생성된 AAV의 양과 최종적으로 회수되는 AAV의 양이 같지 않을 수 있다는 것입니다.

수확된 물질은 일반적으로 여러 후속 공정을 거치게 되며, 정제, 농축 및 여과 등의 과정에서 일정량의 바이러스가 손실될 수 있습니다.

따라서 상류 공정에서 AAV가 정상적으로 생성되었더라도 하류 공정에서 회수율이 낮으면 최종 AAV 역가가 기대보다 낮게 나타날 수 있습니다.

이 때문에 AAV 생산량을 평가할 때는 단순히 최종 vg/mL 값만 확인하기보다 생산 단계와 정제 단계에서 각각 얼마나 회수되는지를 함께 확인하는 것이 좋습니다.

AAV 포장 효율이 낮을 때 확인해야 할 사항

AAV 생산량이 예상보다 낮다면 하나의 원인만을 가정하기보다 생산 공정을 단계별로 확인하는 것이 효과적입니다.

벡터 설계 → ITR 무결성 → 플라스미드 품질 → 세포 상태 → 형질주입 효율 → Rep/Cap 및 보조 기능 → 배양 조건 → 수확 → 정제 및 회수

특정 벡터에서만 AAV 생산량이 낮다면 벡터 크기, ITR 및 GOI의 서열 특성을 우선적으로 검토할 수 있습니다. 반대로 여러 벡터에서 동시에 생산량이 감소한다면 세포 상태, 플라스미드 품질, 형질주입 시스템 및 배양 조건과 같은 공통적인 요소를 확인하는 것이 도움이 됩니다.

또한 최종 AAV 역가가 낮다는 이유만으로 AAV 포장 효율이 낮다고 판단해서는 안 됩니다. 생산 단계에서 바이러스 생성이 감소한 것인지, 아니면 정제 및 농축 과정에서 바이러스 손실이 증가한 것인지 구분할 필요가 있습니다.

결론

AAV 포장 효율은 벡터 설계, ITR 무결성, 플라스미드 품질, 생산 세포 상태, 형질주입 효율, Rep/Cap 발현, 배양 조건, 수확 및 정제 공정 등 여러 요소의 영향을 받습니다.

특히 AAV 생산량이 낮을 때는 특정 한 가지 원인만 확인하기보다 전체 생산 과정을 함께 분석하는 것이 중요합니다. 또한 AAV 생산량과 최종 AAV 역가는 동일한 개념이 아니므로, 바이러스 유전체 역가뿐만 아니라 유전체 무결성, 캡시드 관련 지표 및 공정별 회수율 등을 종합적으로 평가해야 보다 정확하게 판단할 수 있습니다.

AAV 생산 공정의 각 단계에 대한 체계적인 관리와 품질평가를 통해 생산 편차를 줄이고 안정적인 AAV 수율을 확보할 수 있습니다.