AAV 동결·해동 횟수가 많으면 어떤 영향이 있을까?

AAV(Adeno-Associated Virus, 아데노연관바이러스)는 비교적 안정성이 높은 바이러스 벡터로, 적절한 조건에서 보관하면 장기간 사용할 수 있습니다. 하지만 동일한 AAV 샘플을 여러 차례 해동하고 다시 동결하는 과정을 반복하면 바이러스의 안정성과 이후 실험 결과에 영향을 줄 수 있습니다.

다만 동결·해동을 한 번 할 때마다 AAV 역가가 일정하게 감소한다고 단정할 수는 없습니다. AAV 혈청형, 바이러스 농도, 완충액 조성, 안정화제 및 실제 동결·해동 조건에 따라 영향 정도가 달라질 수 있기 때문입니다.

따라서 반복적인 동결·해동의 영향을 평가할 때는 단순히 vg/mL 하나의 지표만 확인하기보다는 바이러스의 물리적 특성과 기능적 활성을 함께 고려하는 것이 중요합니다.

반복적인 AAV 동결·해동으로 발생할 수 있는 문제

1. AAV의 기능적 활성이 감소할 수 있습니다

반복적인 동결·해동은 일부 AAV 입자의 안정성에 영향을 주어 기능적 활성이 감소하는 원인이 될 수 있습니다.

실험에서는 다음과 같은 형태로 나타날 수 있습니다.

• 세포에서의 형질도입 효율 감소
• 목적 유전자의 발현 감소
• 동물실험에서 예상보다 낮은 생물학적 효과

여기서 주의해야 할 점은 유전체 역가와 기능적 활성이 항상 동일하게 변화하는 것은 아니라는 것입니다.

qPCR 또는 ddPCR로 측정하는 vg/mL는 주로 샘플에 존재하는 AAV 유전체의 양을 반영합니다. 이 값만으로 모든 AAV 입자가 정상적인 형질도입 능력을 유지하고 있는지를 판단하기는 어렵습니다.

따라서 반복적인 동결·해동 이후 실험 결과가 떨어졌다면 유전체 역가뿐 아니라 기능적 역가 또는 실제 형질도입 효율도 함께 확인하는 것이 좋습니다.

2. AAV 입자의 응집이 증가할 수 있습니다

동결과 해동 과정에서는 온도와 용액 환경이 반복적으로 변화합니다. 제형이나 보관 조건이 적절하지 않은 경우 이러한 과정에서 일부 AAV 입자가 서로 결합하여 응집체를 형성할 가능성이 있습니다.

AAV 응집이 증가하면 입자 크기와 균일성에 변화가 생길 수 있으며, 이후 세포실험이나 동물 투여 과정에도 영향을 줄 수 있습니다.

특히 고농도 AAV 샘플에서는 응집 여부를 주의해서 확인할 필요가 있습니다. 반복적인 동결·해동 이후 입자 크기 변화, 침전 또는 회수율 저하가 관찰된다면 AAV 응집이나 제형 안정성 문제를 고려해야 합니다.

3. 유리 DNA가 증가할 수 있습니다

정상적인 AAV에서는 바이러스 유전체가 캡시드에 의해 보호됩니다. 반복적인 동결·해동으로 일부 입자의 구조적 안정성이 저하되면 캡시드로 완전히 보호되지 않은 DNA 또는 유리 DNA의 비율이 증가할 가능성이 있습니다.

이 경우 전체 유전체 역가가 크게 감소하지 않더라도 샘플 내 AAV 입자의 상태에는 변화가 발생할 수 있습니다.

따라서 반복적인 동결·해동 이후 총 유전체 역가와 기능적 결과가 서로 일치하지 않는 경우, 유리 DNA나 캡시드 무결성 등 추가적인 품질 특성을 확인하면 원인을 파악하는 데 도움이 됩니다.

4. 실험 결과의 재현성이 떨어질 수 있습니다

실제 연구실에서 반복적인 동결·해동으로 발생하는 가장 현실적인 문제 중 하나는 동일한 AAV 샘플이라도 사용 시점에 따라 상태가 달라질 수 있다는 점입니다.

예를 들어 동일한 배치의 AAV를 처음 사용했을 때는 정상적인 형질도입 결과가 나타났지만, 이후 반복적으로 동결·해동한 샘플에서는 효율이 낮아질 수 있습니다.

이러한 차이를 기록하지 않으면 세포 상태, MOI, 실험 조건 또는 바이러스 생산 배치의 차이로 잘못 판단할 가능성이 있습니다.

따라서 여러 차례 세포실험이나 동물실험에 사용할 AAV라면 샘플별 동결·해동 횟수를 관리하는 것이 좋습니다.

AAV마다 동결·해동 안정성이 다른 이유

모든 AAV가 동일한 수준의 동결·해동 안정성을 보이는 것은 아닙니다.

AAV 혈청형뿐만 아니라 바이러스 농도, 완충액 조성, pH, 안정화제, 계면활성제 및 보관 조건 등이 전체적인 안정성에 영향을 줄 수 있습니다.

예를 들어 일부 AAV 제형에서는 적절한 안정화 성분이나 계면활성제를 사용하여 동결·해동 과정에서 발생할 수 있는 입자 응집이나 용기 표면으로의 비특이적 흡착을 줄일 수 있습니다.

따라서 모든 AAV에 적용할 수 있는 “몇 회 이상 동결·해동하면 사용할 수 없다”라는 절대적인 기준은 없습니다.

특정 AAV 제품의 안정성을 평가해야 한다면 실제 제형을 대상으로 안정성 시험을 수행하고, 유전체 역가, 입자 상태, 기능적 활성 등의 결과를 종합적으로 판단하는 것이 가장 적절합니다.

AAV는 몇 번 동결·해동하면 사용할 수 없을까?

이 역시 AAV 종류와 제형에 따라 달라지기 때문에 일률적인 기준을 적용하기 어렵습니다.

일부 AAV 제형은 여러 차례 동결·해동 후에도 주요 품질 특성이 비교적 안정적으로 유지될 수 있습니다. 반면 특정 혈청형이나 저농도 샘플, 또는 동결·해동 안정성이 충분히 확보되지 않은 제형에서는 반복적인 온도 변화에 의해 기능적 활성이 더 크게 영향을 받을 수 있습니다.

따라서 단순히 **“3회 또는 5회 이상이면 폐기한다”**와 같은 횟수만으로 판단하기보다는, 가능하면 제품별 안정성 자료와 실제 실험 결과를 기준으로 판단하는 것이 좋습니다.

이미 여러 차례 동결·해동한 AAV라면 동결·해동 횟수만으로 샘플이 사용할 수 없다고 판단하기보다는 필요한 품질 및 기능 시험을 통해 상태를 확인하는 것이 바람직합니다.

AAV의 반복적인 동결·해동을 줄이는 방법

실험실에서 가장 간단하고 효과적인 방법은 AAV를 1회 사용량에 맞춰 소분하여 보관하는 것입니다.

여러 번의 세포실험이나 동물실험에 사용할 예정이라면 AAV 전체를 하나의 튜브에 보관하면서 매번 해동하는 것보다, 예상되는 1회 사용량에 맞춰 여러 개의 소분 샘플로 나누어 보관하는 편이 좋습니다.

기본적인 관리 방법은 다음과 같습니다.

AAV 생산 및 정제 → 사용량에 따라 소분 → 저온 보관 → 필요한 튜브만 해동 → 실험에 사용

이렇게 관리하면 동일한 AAV 샘플의 반복적인 동결·해동을 크게 줄일 수 있습니다.

또한 사용 과정에서 불필요하게 실온에 장시간 방치하거나, 짧은 시간 동안 여러 차례 온도 변화를 반복하는 것도 피하는 것이 좋습니다. 해동 후 AAV의 취급 및 재보관 여부는 해당 제품의 보관 및 사용 조건을 함께 확인해야 합니다.

반복 동결·해동한 AAV는 어떤 항목을 확인해야 할까?

AAV의 안정성이 의심되는 경우에는 실험 목적과 필요한 품질 수준에 따라 적절한 분석 항목을 선택할 수 있습니다.