렌티바이러스(Lentivirus)를 생산한 후의 배양 상층액에는 목적하는 렌티바이러스 입자뿐만 아니라, 세포 배양 과정에서 유래한 다양한 불순물도 함께 존재합니다. 초원심분리(Ultracentrifugation), PEG 침전법 등으로 얻어지는 렌티바이러스 침전물(Lentiviral Pellet) 은 순수한 바이러스만으로 구성된 것이 아니라 여러 성분이 혼합된 복합체입니다.
렌티바이러스 원심분리 침전물의 주요 구성 성분
1. 렌티바이러스 입자(주요 구성 성분)
가장 중요한 성분은 감염 능력을 가진 완전한 렌티바이러스 입자입니다. 일반적으로 다음과 같은 구조를 포함합니다.
- 지질 이중막 외피(Lipid Envelope)
- 외피 단백질(예: VSV-G)
- HIV-1 Gag 단백질로 형성된 캡시드(Capsid)
- 바이러스 RNA 유전체
- 역전사효소(Reverse Transcriptase)
- 인테그레이스(Integrase)
- 프로테아제(Protease)
이러한 완전한 바이러스 입자가 최종 감염 역가(TU/mL)를 결정합니다.
2. 불완전한 바이러스 입자
바이러스 패키징 과정에서는 모든 바이러스가 정상적으로 조립되는 것은 아닙니다. 따라서 침전물에는 다음과 같은 감염성이 없는 입자도 함께 존재합니다.
- RNA가 없는 빈 캡시드(Empty Particles)
- 미성숙 바이러스 입자
- 일부 구조 단백질이 결손된 입자
- 감염 능력이 없는 바이러스 입자
이러한 입자는 물리적 입자 수는 증가시키지만 기능적 역가(Functional Titer)에는 기여하지 않습니다.
3. 세포 유래 엑소좀(Exosomes)
HEK293T와 같은 패키징 세포는 배양 과정에서 지속적으로 엑소좀을 분비합니다. 엑소좀의 크기(약 30~150 nm)는 렌티바이러스(약 80~120 nm)와 매우 유사하기 때문에 다음과 같은 특징을 가집니다.
- 렌티바이러스와 함께 쉽게 침전된다.
- 일반적인 원심분리만으로는 완전히 분리하기 어렵다.
- 렌티바이러스 제조 시 대표적인 불순물로 간주된다.
4. 마이크로베지클(Microvesicles)
엑소좀 외에도 패키징 세포는 다음과 같은 세포 유래 소포를 방출합니다.
- 마이크로베지클(100~1000 nm)
- 세포막 파편(Cell Membrane Fragments)
이들 역시 고속 원심분리 과정에서 바이러스와 함께 침전될 수 있습니다.
5. 숙주세포 유래 단백질(Host Cell Proteins, HCP)
침전물에는 다양한 숙주세포 단백질이 포함될 수 있습니다.
- 알부민 계열 단백질
- 세포골격 단백질
- Heat Shock Protein(HSP)
- 핵 단백질
- 막 단백질
이들 단백질은 바이러스 표면에 흡착되거나 응집체를 형성하여 바이러스와 함께 침전되는 경우가 많습니다.
6. 숙주세포 유래 핵산
침전물에는 다음과 같은 핵산이 잔존할 수 있습니다.
- 숙주세포 DNA
- 숙주세포 RNA
- 패키징 플라스미드 잔류 DNA
- 유리 RNA(Free RNA)
Benzonase와 같은 뉴클레아제를 처리하면 이러한 핵산 불순물을 효과적으로 제거할 수 있습니다.
7. 혈청 유래 단백질(혈청 배지를 사용하는 경우)
바이러스를 회수할 때 배지에 FBS가 포함되어 있다면 다음과 같은 혈청 성분도 함께 침전될 수 있습니다.
- BSA(Bovine Serum Albumin)
- 다양한 혈청 단백질
- 지단백질(Lipoproteins)
이 때문에 많은 연구실에서는 바이러스 회수 단계에서 저혈청 또는 무혈청 배지를 사용하여 단백질 불순물을 줄입니다.
8. 응집체(Aggregates)
바이러스 농축 과정에서는 다음과 같은 응집체가 형성될 수 있습니다.
- 바이러스 입자 응집체
- 단백질 응집체
- 지질 응집체
응집은 감염 효율을 낮추고 바이러스 역가 측정 결과에도 영향을 줄 수 있습니다.
농축 방법에 따른 침전물의 순도 비교
침전물 내 불순물을 줄이는 방법
고순도의 렌티바이러스를 얻기 위해서는 다음과 같은 방법이 권장됩니다.
1.바이러스 회수 전에 저혈청 또는 무혈청 배지로 교체합니다.
2.상층액을 저속 원심분리한 후 0.45 μm 필터로 여과하여 세포와 큰 세포 파편을 제거합니다.
3.Benzonase 등의 뉴클레아제를 사용하여 유리 DNA와 RNA를 분해합니다.
4.Sucrose Cushion 초원심분리, 밀도구배 원심분리 또는 크로마토그래피 정제를 통해 엑소좀, 숙주세포 단백질 등의 불순물을 제거합니다.
5.농축 후 PBS 또는 적절한 완충용액(Buffer)으로 버퍼 교환(Buffer Exchange)을 수행하여 PEG나 자당(Sucrose) 등의 잔류물을 제거합니다.
결론
렌티바이러스 원심분리 침전물은 완전한 렌티바이러스 입자만으로 구성된 것이 아닙니다. 실제로는 완전한 바이러스 입자, 불완전한 입자, 엑소좀, 마이크로베지클, 숙주세포 유래 단백질, 숙주세포 유래 핵산, 혈청 단백질 및 다양한 응집체가 함께 포함되어 있습니다.
사용하는 농축 및 정제 방법에 따라 불순물의 양은 크게 달라지며, 이는 최종 바이러스 제제의 순도, 감염 활성 및 실험 재현성에 직접적인 영향을 미칩니다. 따라서 동물실험(in vivo) 이나 고순도 렌티바이러스가 필요한 연구에서는 농축 이후 추가적인 정제 공정을 적용하여 보다 안정적이고 품질이 우수한 렌티바이러스 제제를 확보하는 것이 권장됩니다.
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