AAV 정제 후 역가는 높은데 감염 효율이 낮은 이유는 무엇일까요? 원인과 해결 방법 총정리

AV(Adeno-Associated Virus, 아데노연관바이러스)는 높은 안전성, 낮은 면역원성, 그리고 장기간의 유전자 발현이 가능하다는 장점으로 인해 유전자 기능 연구, 질환 모델 구축 및 유전자 치료 연구에서 가장 널리 사용되는 바이러스 벡터 중 하나입니다.

그러나 실제 연구에서는 다음과 같은 문제를 자주 경험하게 됩니다.

AAV 역가(vg/mL)는 매우 높게 측정되지만, 세포 또는 동물에 감염시킨 후 목표 유전자의 발현이 매우 약하거나 거의 나타나지 않는 경우가 있습니다.

이는 높은 바이러스 역가가 반드시 높은 감염 효율(Transduction Efficiency) 또는 생물학적 활성을 의미하는 것은 아니기 때문입니다.

AAV의 감염 효율은 바이러스 품질, 벡터 설계, 실험 조건 및 숙주 요인 등 다양한 요소의 영향을 받습니다.

이번 글에서는 AAV 정제 후 역가는 높지만 감염 효율이 낮은 주요 원인과 이를 개선하기 위한 방법을 소개합니다.

1. 높은 역가가 높은 감염력을 의미하는 것은 아닙니다

현재 대부분의 AAV 제품은 qPCR 또는 ddPCR을 이용하여 바이러스 유전체 역가(Genome Titer, vg/mL)를 측정합니다.

하지만 vg/mL는 다음과 같은 정보만 제공합니다.

• 바이러스 입자에 포함된 유전체 수
• 바이러스 유전체의 정량 결과

반면 다음 사항은 반영하지 않습니다.

• 바이러스가 실제로 세포에 감염될 수 있는지
• 정상적으로 유전자를 발현할 수 있는지
• 바이러스 입자가 완전한 구조를 갖추고 있는지

따라서 1×10¹³~10¹⁴ vg/mL 이상의 높은 역가를 나타내더라도 실제 감염 효율은 기대보다 낮을 수 있습니다.

2. Empty Capsid(빈 캡시드)의 비율이 높은 경우

가장 흔한 원인 중 하나입니다.

AAV 생산 과정에서는 일반적으로 다음 두 종류의 입자가 생성됩니다.

• Full Capsid(유전체가 포함된 완전 입자)
• Empty Capsid(유전체가 없는 빈 캡시드)

Empty Capsid는 외형상 정상적인 캡시드를 가지고 있지만 내부에 목적 유전자가 존재하지 않습니다.

정제 과정에서 Empty Capsid가 충분히 제거되지 않으면

• 전체 바이러스 입자 수는 많아 보이고
• 역가 역시 높게 측정될 수 있지만
• 실제 유전자를 전달할 수 있는 바이러스 비율은 감소하여
• 감염 효율과 발현 수준이 저하됩니다.

확인 방법

다음과 같은 분석법이 주로 사용됩니다.

• Analytical Ultracentrifugation(AUC)
• Transmission Electron Microscopy(TEM)
• SEC-MALS
• Capsid ELISA와 qPCR의 병행 분석
• Cryo-EM(일부 연구)

고품질 연구용 또는 임상용 AAV에서는 일반적으로 Full/Empty Capsid Ratio가 중요한 품질 지표로 관리됩니다.

3. 바이러스 유전체가 완전하게 포장되지 않은 경우

Empty Capsid가 아니더라도 다음과 같은 문제가 발생할 수 있습니다.

• Partial Genome Packaging
• 유전체 결실
• DNA 분해
• ITR(Inverted Terminal Repeat)의 손상 또는 불완전성

이러한 바이러스는 세포 내로 진입할 수는 있지만 정상적인 유전자 발현은 어렵습니다.

주요 원인은 다음과 같습니다.

• 벡터 설계의 문제
• AAV 최대 패키징 용량(약 4.7 kb)에 가까운 삽입 서열
• ITR의 불안정성
• 포장 효율 저하

권장 분석 방법

• Southern Blot
• Long-read Sequencing
• 다중 위치 ddPCR
• Next-Generation Sequencing(NGS)

이를 통해 바이러스 유전체의 완전성을 확인할 수 있습니다.

4. 적절하지 않은 AAV 혈청형(Serotype) 선택

AAV 혈청형마다 조직 친화성(Tropism)이 다릅니다.

목표 조직에 적합하지 않은 혈청형을 선택하면 바이러스 품질이 우수하더라도 감염 효율은 크게 떨어질 수 있습니다.

혈청형은 다음 요소를 종합적으로 고려하여 선택해야 합니다.

• 실험 동물 종류
• 투여 방법
• 표적 조직
• 혈액-뇌 장벽(Blood-Brain Barrier, BBB) 통과 필요 여부

5. 프로모터(Promoter)의 발현 활성이 충분하지 않은 경우

많은 연구자들이 간과하기 쉬운 요소입니다.

AAV는 정상적으로 세포를 감염했더라도 프로모터 활성이 낮으면 최종적인 형광 신호나 목표 단백질 발현이 매우 약하게 나타날 수 있습니다.

대표적인 프로모터는 다음과 같습니다.

• CMV: 높은 발현 수준이지만 일부 조직에서는 발현이 감소하거나 침묵될 수 있음
• EF1α: 안정적이며 다양한 세포에서 사용 가능
• CAG: 강한 전반적 발현
• hSyn: 신경세포 특이적
• GFAP: 성상교세포 특이적
• Albumin/TBG: 간세포 특이적

실험 목적과 표적 조직에 적합한 프로모터를 선택하는 것이 중요합니다.

6. MOI 또는 투여 용량이 부족한 경우

필요한 바이러스 양은 실험 시스템에 따라 크게 달라집니다.

세포 실험(In Vitro)

• HEK293 세포: 비교적 낮은 MOI에서도 감염 가능
• Primary Cell: 일반적으로 높은 MOI 필요
• 신경세포: 상대적으로 감염이 어려움

동물 실험(In Vivo)

중추신경계, 간, 근육, 안구 등 조직마다 적절한 투여량이 다르므로, 관련 문헌과 예비 실험을 통해 최적 조건을 설정하는 것이 좋습니다.

7. 바이러스 보관 상태가 적절하지 않은 경우

AAV는 반복적인 동결·해동에 민감합니다.

다음과 같은 상황에서는 바이러스 활성이 감소할 수 있습니다.

• 반복적인 Freeze-Thaw
• 장시간 실온 보관
• 4℃에서 장기간 보관
• 안정화제가 없는 상태로 저장
• 강한 교반 또는 반복적인 피펫팅

권장 사항은 다음과 같습니다.

• −80℃에서 장기 보관
• 소분하여 보관하고 반복적인 동결·해동을 피할 것
• 사용 전 얼음 위에서 천천히 해동한 후 부드럽게 혼합할 것

8. 바이러스 순도가 충분하지 않은 경우

정제가 충분하지 않으면 다음과 같은 불순물이 남아 있을 수 있습니다.

• Host Cell Protein(HCP)
• 숙주 세포 DNA
• 플라스미드 잔류물
• 응집체(Aggregates)
• 엔도톡신(Endotoxin)

이러한 불순물은

• 바이러스 안정성 저하
• 세포 독성 증가
• 감염 효율 감소
• 염증 반응 유발

등의 문제를 일으켜 최종 발현에 영향을 줄 수 있습니다.

따라서 고품질 AAV는 일반적으로 다음과 같은 품질관리(QC)를 수행합니다.

• 바이러스 역가 측정
• 순도 분석(SDS-PAGE)
• Capsid 단백질 분석(Western Blot)
• 엔도톡신 시험
• 숙주 세포 DNA 잔류량
• Host Cell Protein(HCP) 잔류량
• 무균 시험
• 마이코플라스마 시험

9. 숙주 요인의 영향

감염 효율은 숙주의 생물학적 특성에도 영향을 받습니다.

예를 들어

• AAV 수용체 발현 수준
• 중화항체(Neutralizing Antibody, NAb)의 존재
• 동물의 연령
• 염증 상태
• 동물 계통(Strain)의 차이

특히 영장류 및 대동물 실험에서는 기존의 중화항체가 AAV 전달 효율을 크게 감소시킬 수 있습니다.

AAV 감염 효율을 높이기 위한 권장 사항

AAV 역가는 높지만 발현이 낮은 경우에는 다음 순서대로 점검하는 것이 좋습니다.

1. 바이러스 품질(Full/Empty Ratio, 순도, 유전체 완전성)을 확인합니다.
2. 목표 조직에 적합한 혈청형을 선택했는지 확인합니다.
3. 프로모터가 실험 목적에 적합한지 평가합니다.
4. MOI 또는 투여 용량을 최적화합니다.
5. 보관 및 운송 과정에서 바이러스 활성이 유지되었는지 확인합니다.
6. 중화항체, 수용체 발현 등 숙주 요인을 함께 고려합니다.

결론

AAV의 높은 vg/mL는 바이러스 유전체 수가 많다는 것을 의미할 뿐이며, 실제 감염 능력이나 유전자 전달 효율을 보장하지는 않습니다.

AAV의 실제 Transduction Efficiency는 Empty Capsid 비율, 유전체 완전성, 혈청형 선택, 프로모터 설계, 투여 용량, 바이러스 순도, 보관 조건 및 숙주 요인 등 다양한 요소의 영향을 받습니다.

따라서 AAV의 품질을 평가할 때는 단순히 vg/mL만 확인하는 것이 아니라 Full/Empty Capsid Ratio, 감염 활성(Infectivity), 유전체 완전성, 순도 및 종합적인 QC 결과를 함께 평가해야 합니다.

철저한 품질관리와 적절한 실험 설계는 보다 안정적이고 재현성 높은 AAV 연구 결과를 얻기 위한 핵심 요소입니다.