AAV 역가가 높음에도 불구하고 발현이 낮게 나타나는 원인

AAV(아데노부속바이러스, adeno-associated virus)를 이용한 실험에서는 “역가(titer)는 충분히 높은데도 목적 유전자의 발현이 약하거나 거의 검출되지 않는” 문제가 드물지 않게 발생합니다.

많은 연구자들은 먼저 “바이러스 품질이 좋지 않은 것은 아닐까”라고 생각하기 쉽지만, 실제로는 높은 역가 = 높은 발현을 의미하지 않습니다. AAV에 의한 유전자 발현은 바이러스 양뿐만 아니라 벡터 설계, 혈청형, 투여 방법, 표적 조직, 생물학적 요인 등 다양한 요소가 복합적으로 관여합니다.

또한 AAV의 “역가”에는 여러 의미가 있습니다. qPCR이나 ddPCR로 측정되는 vg titer는 벡터 게놈 수를 나타내는 값이며, 실제 감염능이나 발현능을 직접적으로 반영한다고 볼 수는 없습니다. 따라서 AAV 실험에서는 단순히 역가만 볼 것이 아니라, 기능적인 도입 효율과 실제 발현량도 함께 평가하는 것이 중요합니다.

아래에서는 AAV의 역가가 높음에도 불구하고 발현이 낮게 나타나는 주요 원인을 설명합니다.

1. AAV 혈청형이 표적 조직에 적합하지 않은 경우

AAV의 감염 효율은 사용하는 **혈청형(serotype)**에 따라 크게 달라집니다. 각 혈청형은 서로 다른 조직 친화성(tropism)을 가지므로, 목적 조직에 적합한 혈청형을 선택하지 않으면 충분한 감염과 발현을 얻기 어렵습니다.

예를 들어,

• AAV2: 망막 및 일부 신경세포에서 자주 사용됨
• AAV8: 간으로의 높은 유전자 전달 효율
• AAV9: 심장, 근육, 중추신경계로의 전달 능력이 비교적 우수함

다만 이러한 경향은 동물종, 투여 경로, 표적 세포, 실험 조건에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어 신경계에서는 AAV2가 항상 최적의 선택은 아니며, AAV1, AAV5, AAV8, AAV9 또는 개량형 캡시드가 더 적합한 경우도 있습니다.

동일한 역가라 하더라도 적절한 혈청형을 선택하면 발현 효율이 크게 개선될 수 있습니다.

2. 프로모터가 표적 세포에 적합하지 않은 경우

프로모터는 유전자 발현량을 결정하는 중요한 요소입니다.

예를 들어,

• CMV: 여러 세포에서 강력한 발현을 유도하지만, 일부 조직이나 장기 발현 조건에서는 침묵화(silencing)가 일어나기 쉬움
• CAG: 다양한 조직에서 안정적이고 높은 발현을 기대할 수 있음
• EF1α: 비교적 장기간 안정적인 발현에 사용됨
• Synapsin(Syn): 신경세포 특이적
• GFAP: 성상교세포(astrocyte) 특이적
• Albumin / TBG: 간세포 특이적

표적 세포에 적합한 프로모터를 사용하지 않으면, 충분한 바이러스가 도입되더라도 발현은 낮게 나타날 수 있습니다.

특히 in vivo 실험에서는 CMV 프로모터가 강력하더라도 조직에 따라 발현이 약해지거나 시간이 지나면서 침묵화될 수 있습니다. 따라서 장기 발현이나 세포 특이적 발현을 목적으로 하는 경우에는 CAG, EF1α, CBh 또는 조직 특이적 프로모터의 사용을 검토할 필요가 있습니다.

3. 투여량(dose)이 부족한 경우

바이러스의 역가와 투여량은 서로 다른 개념입니다.

예를 들어, 1×10131×1013 vg/mL와 같이 고역가 제제라 하더라도 투여 부피가 적으면 총 투여 바이러스 수가 부족할 수 있습니다. 반대로 중간 정도의 역가라도 충분한 투여량을 사용하면 높은 발현을 얻을 수 있습니다.

따라서 실험에서는 농도로서의 역가뿐만 아니라,

• 총 투여 게놈 수, 즉 total vg
• 동물 체중당 투여량, 즉 vg/kg
• 배양세포에서는 세포 수당 투여량, 즉 vg/cell 또는 MOI

를 적절히 설계하는 것이 중요합니다.

4. 투여 경로가 적절하지 않은 경우

AAV는 투여 방법에 따라 표적 조직으로의 도달 효율이 크게 달라집니다.

대표적인 투여 방법으로는,

• 정맥내 투여(IV)
• 꼬리정맥 투여
• 뇌내 주입
• 척수강내 투여(IT)
• 뇌실내 투여(ICV)
• 근육내 투여(IM)
• 안구내 투여

등이 있습니다.

적절한 투여 경로를 선택하지 않으면 충분한 양의 AAV가 표적 조직에 도달하지 못해 발현 저하로 이어질 수 있습니다. 예를 들어 전신 투여의 경우 간 등에 많이 분포하여 목적 조직으로 전달되는 양이 상대적으로 적어질 수 있습니다.

5. 발현을 평가하는 시점이 너무 이른 경우

AAV는 감염 직후 최대 발현을 보이는 것이 아닙니다.

일반적으로,

• 배양세포: 약 2–7일
• 마우스: 약 2–4주
• 영장류: 4–8주 이상

이 지나면서 발현이 안정화되는 경우가 많습니다.

투여 직후 바로 분석하면 역가가 높더라도 충분한 발현을 확인하지 못할 수 있습니다. 특히 single-stranded AAV(ssAAV)의 경우 이중가닥화 과정이 필요하기 때문에 발현이 시작되기까지 시간이 더 걸릴 수 있습니다.

반면 self-complementary AAV(scAAV)는 발현 개시가 빠른 경향이 있지만, 일반 AAV보다 탑재 가능한 서열 크기가 작다는 제한이 있습니다.

6. 벡터 설계에 문제가 있는 경우

벡터 설계 역시 발현 효율에 큰 영향을 미칩니다.

예를 들어,

• 유전자 크기가 AAV의 탑재 용량인 약 4.7 kb를 초과하는 경우
• Kozak 서열이 최적화되어 있지 않은 경우
• polyA 신호 선택이 부적절한 경우
• WPRE와 같은 발현 증강 서열이 없는 경우
• ORF 설계에 오류가 있는 경우
• 태그나 링커가 단백질의 발현, 위치, 안정성에 영향을 주는 경우
• ITR 서열에 변이 또는 결손이 있는 경우

등이 원인이 될 수 있습니다.

AAV의 탑재 용량인 약 4.7 kb는 프로모터, 목적 유전자, 태그, WPRE, polyA, ITR을 포함한 전체 크기로 고려해야 합니다. 벡터 전체 길이가 지나치게 크면 완전한 게놈이 패키징되기 어려워지며, 겉보기 역가가 높더라도 기능적인 발현은 저하될 수 있습니다.

또한 WPRE는 발현 증강에 유용한 경우가 많지만 벡터 용량을 차지하므로, 목적 유전자가 큰 경우에는 사용 여부를 신중히 판단해야 합니다.

7. 바이러스 품질에 문제가 있는 경우

qPCR이나 ddPCR로 측정되는 역가는 주로 벡터 게놈 수(vg)를 나타내는 값일 뿐, 감염능이나 품질을 직접적으로 반영하지는 않습니다.

AAV의 역가는 주로 다음과 같이 구분할 수 있습니다.

• vg titer: 벡터 게놈 수
• physical particle titer: 캡시드 입자 수
• infectious titer / functional titer: 실제로 세포에 도입되어 발현으로 이어지는 기능적 입자 수

따라서 vg titer가 높더라도 감염성 입자나 발현 가능한 입자의 비율이 낮으면 목적 유전자의 발현은 낮게 나타납니다.

다음과 같은 품질 문제가 있을 경우, 고역가임에도 발현이 저하될 수 있습니다.

• Empty capsid(빈 캡시드)의 비율이 높은 경우
• 불완전한 벡터 게놈이 패키징된 경우
• 게놈 손상 또는 단편화
• 잔류 숙주 유래 DNA나 단백질
• 엔도톡신 오염
• 부적절한 보관 조건
• 반복적인 동결-해동으로 인한 감염능 저하

따라서 역가뿐만 아니라 완전 게놈 비율, 빈 캡시드 비율, 순도, 엔도톡신, SDS-PAGE, 전자현미경, ddPCR, 감염성 평가 등을 포함한 종합적인 품질 평가가 중요합니다.

8. 표적 세포 측 요인

바이러스 자체에 문제가 없더라도 표적 세포의 상태에 따라 발현 효율은 달라질 수 있습니다.

예를 들어,

• AAV 수용체 또는 공동수용체의 발현량이 낮은 경우
• 세포 종류에 따른 감염 감수성 차이
• 세포 생존율이 낮은 경우
• 세포주기나 대사 상태
• 염증 또는 면역반응에 의한 발현 억제
• 세포내 수송, 탈외피, 핵 이동, 이중가닥화 등의 과정이 비효율적인 경우

이러한 요인들이 도입 후 유전자 발현에 영향을 줄 수 있습니다.

9. 혈청 내 중화항체(Neutralizing Antibodies)의 영향

in vivo 실험에서는 AAV에 대한 기존 중화항체(NAbs)가 존재하면, AAV가 표적 세포에 도달하기 전에 중화되어 발현이 현저히 감소할 수 있습니다.

특히 사람이나 비인간 영장류에서는 과거 감염 이력으로 인해 항체를 보유한 경우가 있으므로, 혈청형 선택과 항체 스크리닝이 중요합니다.

또한 전신 투여에서는 중화항체의 영향을 받기 쉬우며, 낮은 항체가에서도 도입 효율이 크게 감소할 수 있습니다.

10. 목적 유전자 또는 검출 시스템의 문제

AAV 도입 자체는 성공했더라도 목적 유전자나 검출 방법에 문제가 있는 경우, 발현이 낮은 것처럼 보일 수 있습니다.

예를 들어,

• 목적 단백질이 불안정하여 쉽게 분해되는 경우
• 목적 단백질에 세포독성이 있어 발현 세포가 감소하는 경우
• 번역 후 수식이나 세포 내 위치가 예상과 다른 경우
• 형광단백질의 성숙에 시간이 걸리는 경우
• 항체의 감도나 특이성이 충분하지 않은 경우
• qPCR, RT-qPCR, Western blot, 면역염색 등의 검출 조건이 최적화되어 있지 않은 경우

이러한 경우 AAV 벡터나 역가에 문제가 없어도, 겉보기에는 “발현이 낮다”고 판단될 수 있습니다.

정리

AAV의 역가가 높음에도 불구하고 발현이 낮게 나타나는 경우, 그 원인이 반드시 바이러스 역가 자체에 있는 것은 아닙니다. 대부분의 경우 혈청형 선택, 프로모터 설계, 투여량 및 투여 경로, 분석 시점, 벡터 구성, 바이러스 품질, 표적 세포의 상태, 숙주의 면역반응, 나아가 목적 유전자나 검출 시스템의 문제 등 여러 요인이 복합적으로 관여합니다.

특히 중요한 점은 qPCR이나 ddPCR로 측정한 vg titer가 높다고 해서 반드시 높은 감염능이나 높은 발현을 의미하지는 않는다는 것입니다. AAV의 성능을 평가할 때는 vg titer뿐만 아니라 functional titer, 빈 캡시드 비율, 완전 게놈 비율, 순도, 표적 세포에서의 실제 발현량 등을 종합적으로 확인해야 합니다.

따라서 AAV 실험을 성공적으로 수행하기 위해서는 역가만을 지표로 삼기보다는, 벡터 설계부터 품질 관리, 투여 조건, 분석 계획, 검출 시스템의 타당성까지 종합적으로 최적화하는 것이 중요합니다. 기대한 만큼의 발현이 얻어지지 않는 경우에는 각 단계를 체계적으로 재검토함으로써 원인을 규명하고 개선 방안을 찾을 수 있습니다.