AAV 삼질 플라스미드 패키징 및 생산 시스템 (Triple Plasmid Packaging System)

AAV 삼질 플라스미드 시스템은 재조합 아데노연관바이러스(recombinant adeno-associated virus, rAAV) 생산을 위한 표준적인 in vitro 제조 방식으로, 연구용 및 비임상 단계에서 널리 사용되고 있습니다.

1. 트랜스퍼 플라스미드 (Transfer / Vector Plasmid)

역할:AAV를 통해 전달하고자 하는 유전자 발현 카세트를 포함합니다.

주요 구성 요소:

• 5′ ITR / 3′ ITR (일반적으로 AAV2 유래 ITR)

• 프로모터 (CMV, CAG, hSyn, U6 등)

• 표적 유전자(GOI), shRNA 또는 sgRNA

• polyA 신호 서열

※ AAV 유전체의 복제 및 패키징에 필수적인 요소는 ITR 서열이며,ITR 사이에 위치한 유전자 서열만이 바이러스 입자에 포장됩니다.

2. Rep/Cap 플라스미드 (Packaging Plasmid)

역할:AAV 유전체 복제 및 캡시드 형성에 필요한 바이러스 단백질을 제공합니다.

포함 유전자:

• rep 유전자: AAV 유전체 복제 및 패키징 조절

• cap 유전자: AAV 혈청형 및 조직 친화성 결정 (AAV2, AAV8, AAV9 등)

※ rep 유전자는 일반적으로 AAV2 유래이며,cap 유전자의 종류에 따라 최종 AAV 혈청형이 결정됩니다.

3. 헬퍼 플라스미드 (Helper Plasmid)

역할:아데노바이러스 유래 보조 인자를 제공하여 HEK293 계열 세포에서 AAV의 효율적인 생산을 가능하게 합니다.

주요 유전자:

• E2A

• E4

• VA RNA

※ 본 플라스미드는 E1 유전자를 포함하지 않으며,E1 기능은 HEK293 세포에서 보완됩니다.해당 보조 유전자는 AAV 바이러스 입자에 포장되지 않습니다.

4. 삼질 플라스미드 시스템의 작동 원리

HEK293 또는 HEK293T 세포에 세 종류의 플라스미드를 일정 비율로 공동 트랜스펙션하면,

• 헬퍼 인자에 의해 AAV 복제 환경이 형성되고
• Rep 단백질이 ITR 서열을 포함한 유전체 복제를 유도하며
• Cap 단백질이 캡시드를 형성하여 유전체를 포장하고
• 복제 능력이 없는 재조합 AAV(rAAV)가 생성됩니다.

5. 시스템의 특징

• 야생형 AAV가 생성되지 않는 높은 안전성

• 혈청형 및 발현 카세트 설계의 높은 유연성

• 검증된 표준 생산 공정

• 다양한 유전자 기능 분석 및 in vivo 연구에 적용 가능

6. 주요 적용 분야

• 유전자 과발현 (Overexpression)

• 유전자 발현 억제 (shRNA / miRNA)

• 조건부 유전자 제거 (AAV-Cre)

• CRISPR/Cas9 기반 유전자 편집

• 체내 동물 모델 구축