AAV(아데노부속바이러스) Knockdown / Overexpression 자주 묻는 질문

본 FAQ는 AAV를 이용한 유전자 발현 억제(Knockdown) 및 유전자 과발현(Overexpression) 연구에서 연구자분들이 자주 문의하시는 내용을 정리한 자료입니다.

Q1. AAV로 유전자 Knockout(KO)이 가능한가요?

AAV 자체에는 유전자 편집 기능이 없기 때문에 단독으로 유전자 Knockout(KO)을 수행할 수는 없습니다. AAV knockdown은 shRNA 또는 miRNA를 이용하여 표적 유전자의 mRNA 발현을 억제하는 방식입니다. KO가 필요한 경우 CRISPR/Cas9 시스템과의 병용이 일반적입니다.

Q2. AAV knockdown에 가장 많이 사용되는 방법은 무엇인가요?

주로 다음 두 가지 전략이 사용됩니다.

• AAV-shRNA
• AAV-miRNA(miR-shRNA)

miRNA 기반 구조는 내인성 miRNA 경로와 유사하여, in vivo 실험에서 독성이 낮고 장기적으로 안정적인 knockdown이 가능합니다.

Q3. AAV-shRNA에서 세포 독성이 발생할 수 있는 이유는 무엇인가요?

shRNA가 과도하게 발현될 경우, 세포 내 miRNA 처리 경로가 포화되어 정상적인 유전자 조절에 영향을 줄 수 있습니다. miRNA 기반 설계 또는 발현량 조절을 통해 이러한 위험을 줄일 수 있습니다.

Q4. Knockdown 효과는 언제부터 확인할 수 있나요?

• in vitro: 보통 3–7일 이내
• in vivo: 약 2–4주 후 안정적인 knockdown 효과 확인 가능

Q5. Knockdown 효율이 낮은 원인은 무엇인가요?

• 표적 서열 설계 미흡
• 프로모터 선택 부적절
• AAV 혈청형과 표적 조직의 불일치
• 투여 바이러스 용량 부족

Q6. AAV로 과발현 가능한 유전자 크기 제한은?

AAV의 최대 패키징 용량은 약 4.7 kb(ITR 포함)입니다. 더 큰 유전자의 경우, 절단형 construct 또는 Dual AAV 전략을 사용할 수 있습니다.

Q7. In vivo에서 발현이 느린 이유는 무엇인가요?

AAV는 단일가닥 DNA 바이러스로, 세포 내에서 이중가닥으로 전환된 후 전사가 시작되기 때문에 in vivo에서는 일반적으로 2–4주 후 발현이 안정화됩니다.

Q8. AAV 벡터는 숙주 게놈에 삽입되나요?

AAV는 주로 에피좀(eposomal) 형태로 존재하며, 숙주 게놈에 무작위로 삽입될 확률은 매우 낮아 안전성이 높은 벡터로 평가됩니다.

Q9. 과발현 신호가 보이지 않는 이유는 무엇인가요?

• 프로모터의 in vivo 침묵(silencing)
• 유전자 크기가 패키징 한계에 근접 또는 초과
• 전사 후 조절 또는 스플라이싱 문제
• 분석 시점이 너무 이른 경우

Q10. Knockdown과 Overexpression 중 어떤 방법을 선택해야 하나요?

• 유전자 기능 억제 목적: AAV knockdown
• 유전자 기능 증강 또는 보완 목적: AAV overexpression

연구 목적과 실험 시스템에 따라 최적의 전략을 선택하는 것이 중요합니다.

Q11. AAV 발현은 얼마나 지속되나요?

비분열 또는 저분열 세포에서는 수개월에서 수년까지 안정적인 발현이 유지될 수 있습니다.

Q12. 대조 벡터가 필요한가요?

신뢰성 있는 결과를 위해 다음과 같은 대조군 설정을 권장합니다.

• 음성 대조(Empty vector / Scramble)
• 양성 대조 벡터