FAQ

AAV를 활용한 in vitro 감염 실험 진행 시 다음과 같은 핵심 요소를 고려하시는 것을 권장합니다.

• 혈청형(Serotype) 선택: In vitro 연구에서는 주로 AAV-DJ와 AAV6가 사용됩니다. AAV-DJ는 일반적으로 배양 세포의 80% 이상에 높은 감염 효율을 보이며, AAV6는 특히 혈액 유래 세포(Blood-derived cells) 감염에 매우 효과적입니다.
• 농도 구배 희석 감염(Gradient dilution infection): 생체 내(in vivo) 실험과 마찬가지로, 본 실험 전 3~4단계의 농도 구배(Gradient dose)로 감염 실험을 먼저 진행해 보시는 것을 권장합니다. 이를 통해 목적 유전자(Transgene)의 최적 발현 수준을 확인하고, 해당 처리 농도에서 세포 독성(Cytotoxicity)이 발생하지 않는지 검증할 수 있습니다.
• 분석 시점(Assay time): 전달 효과를 정확하게 평가하기 위해, 일반적으로 감염 후 2~7일 사이에 분석(Assay)을 수행하는 것이 적절합니다.

Serotype selection: If you’re uncertain about the best AAV serotype for your experiments, we recommend testing at least three different serotypes in your system using our control rAAV with fluorescent reporter constructs.

Gradient dilution infection: Since transgene expression levels can vary by gene, we suggest performing 3-4 AAV gradient dose injections to identify the ideal expression level before starting formal experiments.

Experimental control: Use a GFP-positive control vector that matches the serotype and promoter of your experimental vector.

재조합 AAV(rAAV)는 외래 유전자를 전달하는 매우 강력한 플랫폼으로, 생체 내(In vivo) 동물 실험 연구에서의 활용도가 빠르게 증가하고 있습니다.

그러나 최적의 투여 경로 및 부위(Injection site), rAAV 투여 용량(Quantity/Total dose), 투여 농도(Concentration), 그리고 발현 유도 기간(Incubation/Expression period)은 표적 장기나 질환 모델 등 구체적인 실험 목적과 연구 분야에 따라 매우 다양합니다.

이러한 실험적 변수들로 인해 모든 동물 실험에 일률적으로 적용할 수 있는 표준 투여 프로토콜(Universal protocol)은 존재하지 않습니다. 따라서 연구자는 각자의 고유한 연구 목표에 맞춰 문헌 고찰과 사전 파일럿 연구(Pilot study)를 통해 해당 변수들을 독립적으로 탐색하고 최적화해 나가는 접근 방식이 필요합니다.

성공적인 AAV in vitro 감염 실험을 위해 다음 세 가지 핵심 사항을 권장해 드립니다.

• 혈청형(Serotype) 선택: In vitro 세포 배양 환경에서는 일반적으로 AAV-DJ와 AAV6가 가장 많이 활용됩니다. 일반적인 세포 배양 조건에서 AAV-DJ는 80% 이상의 광범위한 세포주에 감염 효율을 나타내며, AAV6는 혈액 유래 세포(Blood-derived cells)에 대해 가장 강력한 감염 효율을 보입니다.
• 농도 구배 희석 감염(Gradient dilution infection): rAAV에 의한 목적 유전자(Transgene)의 발현 수준은 유전자 종류에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 따라서 본 실험에 들어가기 전, 3~4단계의 농도 구배(Gradient dose)로 처리해 보실 것을 권장합니다. 이를 통해 각 rAAV의 최적 유전자 발현 수준을 설정하고 처리 농도에서의 세포 독성(Cytotoxicity) 유무를 사전에 검증할 수 있습니다.
• 분석 시점(Assay time): 일반적으로 감염 후 2~7일 사이에 발현 분석을 진행하는 것을 권장합니다.

성공적인 AAV 실험 설계를 위해 다음 세 가지 핵심 사항을 권장해 드립니다.

• 혈청형(Serotype) 선택: 연구 목적에 가장 적합한 AAV 혈청형을 결정하기 어려운 경우, 당사의 rAAV 형광 리포터 벡터(Fluorescent reporter constructs)를 활용하여 실험 시스템에서 3가지 이상의 서로 다른 혈청형을 대상으로 감염 효율을 사전 테스트해 보실 것을 권장합니다.
• 농도 구배 희석 감염(Gradient dilution infection): rAAV에 의한 목적 유전자(Transgene)의 발현 수준은 유전자의 종류와 특성에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 따라서 본 실험에 들어가기 전, 3~4단계의 농도 구배(Gradient dose)로 감염 실험을 수행하여 각 rAAV의 최적 발현 수준을 결정하시는 것을 권장합니다.
• 실험 대조군(Experimental control) 설정: 실험의 신뢰성과 재현성을 확보하기 위해, 본 실험 벡터와 동일한 혈청형 및 프로모터를 적용한 **GFP 양성 대조군 벡터(Positive control vector)**를 함께 사용하실 것을 권장합니다.

재조합 AAV(rAAV)는 외래 유전자를 전달하는 매우 강력하고 효과적인 도구로서, in vivo(생체 내) 연구 분야에서의 활용도가 급격히 증가하고 있습니다.

그러나 연구 분야 및 세부 실험 조건에 따라 최적의 투여 부위/경로(Injection site), rAAV 투여량(Quantity), 바이러스 농도(Concentration), 그리고 발현 유도 기간(Incubation period)이 크게 달라집니다. 이와 같은 다양한 변수로 인해 모든 실험에 일괄 적용할 수 있는 단일 '범용(Universal) AAV 투여 프로토콜'을 규정하기는 어렵습니다.

따라서 연구진께서는 구체적인 연구 목표와 표적 조직의 특성에 맞추어 다음 핵심 변수들을 독립적으로 탐색하고 최적화(Optimization)하셔야 합니다:

• 투여 부위 및 경로 (Injection Site/Route): 표적 장기 및 세포 특이성에 맞춘 국소 투여(예: 뇌정위 주사, 망막하 주사 등) 또는 전신 투여(정맥 주사 등) 선택
• rAAV 역가 및 투여량 (Dose & Quantity): 개체당 총 유전체 복제수(Total GC/animal) 기준 적정 투여량 설정
• 투여 농도 및 부피 (Concentration & Volume): 조직 손상이나 주입 압력을 최소화하면서 충분한 역가를 전달할 수 있는 적정 부피 설계
• 발현 유도 기간 (Incubation/Expression Period): rAAV 형질도입 후 표적 단백질이 안정적으로 발현하기까지 소요되는 최적 관찰 시점 선정

AAV 벡터는 우수한 안전성, 낮은 면역원성(Immunogenicity), 비분열 세포(Non-dividing cells) 형질도입 능력, 그리고 숙주 유전체에 삽입되지 않으면서도 장기적인 유전자 발현을 유도하는 특성 면에서 독보적인 경쟁력을 지니고 있습니다. 이러한 장점으로 인해 장기적 발현 안정성과 안전성이 최우선으로 요구되는 유전자 치료제 개발 분야에서 가장 주목받고 있습니다.

다만, 약 4.7kb 내외의 제한적인 유전자 수용 한계 용량(Packaging capacity)은 크기가 큰 외래 유전자를 전달할 때 한계점으로 작용할 수 있습니다.

주요 바이러스 벡터 간의 특성 비교는 다음과 같습니다:

• 아데노바이러스(Adenovirus) 및 단순포진바이러스(HSV): 상대적으로 큰 유전체 용량을 탑재할 수 있으나, 높은 면역원성 유발 및 체내 안전성 우려가 상대적으로 큽니다.
• 렌티바이러스(Lentivirus) 및 레트로바이러스(Retrovirus): 숙주 유전체 내로 직접 삽입(Genome integration)되어 안정적인 장기 발현을 제공하지만, 삽입 돌연변이 유발(Insertional mutagenesis) 및 발암 위험성을 동반합니다.
• 아데노부속바이러스(AAV): 숙주 유전체에 삽입되지 않고 주로 에피솜(Episome) 형태로 존재하여 삽입 변이 위험을 최소화하며, 다양한 혈청형(Serotypes)을 활용해 특정 조직을 표적화(Tissue-specific targeting)할 수 있습니다.

이처럼 AAV 고유의 우수한 안전성과 조직 특이적 전달 이점을 활용함으로써, 위험 요소를 최소화한 다양한 유전 질환 치료제를 성공적으로 설계할 수 있습니다. 이러한 특성 덕분에 AAV는 기초 연구뿐만 아니라 임상 유전자 치료제 개발 파이프라인에서 가장 선호되는 벡터 플랫폼으로 자리잡고 있습니다.

As of now, nine naturally occuring serotypes of human AAV have been discovered (AAV1/2/3/4/5/6/7/8/9) and widely applied in scientific research. AAV10 and AAV11 were first discovered in non-human primates in 2004, and no cross-reactivity was observed between AAV10, AAV11, and AAV2, making them promising candidate vectors. Subsequently, researchers isolated AAV12 and AAV13 from simian adenovirus, with limited research on these serotypes currently. Based on these wild-type AAVs, researchers have developed many AAV mutants, such as AAV-DJ and the PHP series, through various modification strategies.

Due to differences in the spatial structure of capsid proteins among AAV serotypes, there are significant variations in their recognition and binding to cell surface receptors, leading to tropism of different AAV serotypes for different tissues. When selecting serotypes, experimental purposes can refer to AAV serotypes used in peer-reviewed literature. For example, AAV1 and AAV9 are more commonly used in brain research than other wild-type AAV serotypes, while AAV6 exhibits higher lymphocyte selectivity.

There are also many engineered serotypes that have been modified or engineered to enhance specific properties for gene therapy applications. These modifications can include alterations to the capsid proteins to change tissue tropism, improve transduction efficiency, evade immune responses, or increase payload capacity. Engineered AAV serotypes have been developed through various strategies such as directed evolution, rational design, or hybridization of existing serotypes. These engineered serotypes offer enhanced performance and versatility, making them valuable tools for targeted gene delivery in biomedical research and therapeutic applications.

PackGene offers nearly 100 serotypes for our packaging service to assist your research work.

Additionally, the development of AAV mutant serotypes with more tissue specificity and stronger infectivity is crucial for innovation in AAV-mediated gene delivery. PackGene provides comprehensive AAV serotype engineeringg services to offer you a one-stop solution.

However, despite the tissue tropism of wild-type AAVs to some extent, the infection of non-target tissues cannot be completely avoided. In such cases, combining tissue- or cell-specific promoters with serotypes can greatly enhance AAV specificity. PackGene offers various tissue-specific promoters, such as the muscle-specific promoter MHCK7-2 and the liver-specific promoter TBG669. Our piVector Design embed in our online ordering system offers various promoters including universal and tissue specific promoters. You may easily build your vector into our AAV backbones that have been rigorously verified for effective viral packaging.