AAV 플라스미드 순도가 바이러스 생산량에 영향을 미칠까요?

재조합 AAV（rAAV）를 생산할 때 플라스미드 DNA를 이용한 일시적 형질도입은 널리 사용되는 생산 방법 중 하나입니다. 이 과정에서 플라스미드 DNA는 중요한 생산 원료에 해당합니다.

AAV 생산량이 감소하면 많은 연구자들이 먼저 HEK293 세포 상태, 형질도입 시약, 배양 조건 등을 확인합니다. 그러나 플라스미드 자체의 품질도 AAV 생산 결과에 영향을 줄 수 있는 중요한 요소입니다.

특히 플라스미드 로트를 변경한 후 AAV 역가가 낮아졌거나, 동일한 벡터를 사용한 반복 실험에서 생산량의 차이가 나타난 경우에는 플라스미드 품질을 다시 확인할 필요가 있습니다.

그렇다면 AAV 플라스미드의 순도는 바이러스 생산량에 영향을 미칠까요?

결론부터 말하면, 영향을 미칠 수 있습니다. 하지만 AAV 역가의 변화를 플라스미드 순도만으로 설명해서는 안 됩니다.

플라스미드에 포함된 RNA, 단백질, 염류, 엔도톡신 등의 불순물은 DNA의 형질도입 특성이나 생산 세포의 상태에 영향을 줄 가능성이 있습니다. 또한 DNA 무결성, 플라스미드 구조, ITR 상태, 핵심 서열의 정확성 등도 AAV 생산과 관련이 있습니다.

따라서 AAV 생산 결과를 평가할 때는 단순히 “플라스미드 순도”만 확인하기보다, 플라스미드의 전반적인 품질과 AAV 생산 공정 전체를 함께 검토하는 것이 중요합니다.

1. AAV 생산에 고품질 플라스미드가 필요한 이유

HEK293 세포 또는 그 유래 세포를 이용한 일시적 형질도입은 rAAV 생산에 널리 사용되는 방법 중 하나입니다.

대표적인 3-플라스미드 시스템에서는 일반적으로 다음과 같은 플라스미드를 사용합니다.

• GOI와 발현 카세트를 포함하는 AAV 트랜스퍼 플라스미드
• Rep/Cap을 제공하는 플라스미드
• 헬퍼 기능을 제공하는 플라스미드

이들 플라스미드가 생산 세포에 도입되면 각각의 기능을 수행하고, AAV 게놈의 복제, 바이러스 단백질 발현, 캡시드 형성 및 게놈 패키징 등의 과정을 거쳐 rAAV 입자가 형성됩니다.

따라서 플라스미드는 단순히 필요한 DNA 농도를 충족하는 것만으로 충분하지 않습니다. 적절한 순도와 무결성, 구조적 안정성을 갖추는 것이 중요합니다.

플라스미드 자체에 명확한 품질 문제가 있다면 DNA 투입량이 규정에 맞더라도 안정적인 형질도입이나 AAV 생산이 이루어지지 않을 수 있습니다.

AAV 생산에 사용하는 플라스미드는 일반적으로 다음과 같은 항목을 종합적으로 평가합니다.

• DNA 농도
• DNA 순도
• DNA 무결성
• 플라스미드 구조 및 토폴로지
• 엔도톡신 수준
• 핵심 서열의 정확성
• ITR 무결성

특히 AAV 트랜스퍼 플라스미드에서는 ITR의 상태를 중요하게 확인해야 합니다.

2. 플라스미드 내 불순물이 AAV 생산에 영향을 줄 수 있는 이유

2.1 RNA, 단백질 및 염류 잔류물

플라스미드 DNA를 제조하고 정제하는 과정에서 RNA, 단백질, 염류 또는 기타 공정 유래 잔류물이 충분히 제거되지 않으면 DNA 품질이나 형질도입 시스템의 성능에 영향을 줄 수 있습니다.

AAV 일시적 형질도입 생산에서는 일반적으로 여러 종류의 플라스미드를 생산 세포에 동시에 도입합니다.

DNA 품질 이상으로 인해 형질도입 효율이 감소하면 세포 내로 유입되어 AAV 생산에 활용되는 플라스미드의 양에도 영향을 줄 수 있습니다. 그 결과 최종 AAV 생산량이 감소할 가능성이 있습니다.

다만 실제 영향은 불순물의 종류와 잔류량, 사용 세포, 형질도입 방식 등에 따라 달라집니다. 특정 순도 지표 하나만으로 AAV 역가가 얼마나 변할지 예측할 수는 없습니다.

2.2 엔도톡신 잔류

엔도톡신은 플라스미드 품질 관리에서 중요하게 확인해야 하는 항목입니다.

플라스미드 제조에는 일반적으로 대장균과 같은 세균이 사용됩니다. 정제 과정에서 엔도톡신이 충분히 제거되지 않으면 최종 플라스미드 제제에 잔류할 수 있습니다.

AAV 생산에서 엔도톡신은 관리가 필요한 품질 위험 요소 중 하나입니다. 또한 엔도톡신 수준이 높으면 생산 세포의 상태에 부정적인 영향을 미쳐 형질도입이나 AAV 생산의 안정성을 저하시킬 가능성이 있습니다.

그러나 “플라스미드의 엔도톡신 수준이 높을수록 AAV 역가는 반드시 낮아진다”고 단정해서는 안 됩니다.

실제 영향은 세포 유형, 생산 시스템, 엔도톡신 수준 및 기타 공정 조건에 따라 달라질 수 있습니다.

따라서 AAV 저역가의 원인을 조사할 때는 엔도톡신을 플라스미드 품질의 중요한 평가 항목으로 확인하되, 다른 요인도 함께 검토해야 합니다.

3. AAV 플라스미드 품질은 A260/A280만으로 판단할 수 없습니다

AAV 생산에 사용하는 플라스미드의 품질을 평가할 때 A260/A280 및 A260/A230과 같은 흡광도 비율을 자주 활용합니다.

이러한 지표는 DNA 시료에 단백질, 염류 등 불순물이 존재하는지 추정하는 데 도움이 됩니다. 그러나 해당 수치가 정상이라고 해서 플라스미드가 AAV 생산에 적합한 상태라고 단정할 수는 없습니다.

예를 들어 A260/A280이 적정 범위에 있더라도 DNA 분해, 구조적 이상 또는 핵심 서열의 변화가 존재할 가능성이 있습니다.

따라서 AAV 패키징 결과에 변화가 나타났다면 DNA 농도와 A260/A280뿐 아니라 DNA 무결성, 플라스미드 구조 및 핵심 서열을 함께 확인해야 합니다.

AAV 트랜스퍼 플라스미드의 경우 ITR 무결성도 중점적으로 확인할 필요가 있습니다.

4. AAV 트랜스퍼 플라스미드에서 ITR이 중요한 이유

ITR（Inverted Terminal Repeat, 역말단 반복서열）은 AAV 벡터 게놈 양쪽 말단에 위치하는 중요한 시스 작용 서열입니다.

rAAV 생산 과정에서 ITR은 벡터 게놈의 복제 및 패키징과 관련된 과정에 관여합니다. 따라서 트랜스퍼 플라스미드의 ITR 상태는 AAV 생산을 평가할 때 중요한 요소입니다.

ITR은 특유의 서열 및 구조적 특징을 가지고 있기 때문에 플라스미드 증폭, 정제, 보관 및 분석 과정에서 일반적인 서열과 다른 구조적 문제가 발생할 가능성이 있습니다.

따라서 플라스미드 농도와 A260/A280 등 일반적인 품질 지표가 정상이라고 하더라도 ITR에 이상이 없다고 완전히 판단할 수는 없습니다.

ITR에 결실, 재배열 또는 기타 구조적 변화가 발생하면 벡터 게놈의 복제와 패키징에 영향을 주어 AAV 생산량이나 제품 품질에 변화를 일으킬 가능성이 있습니다.

동일한 AAV 벡터에서 플라스미드 로트를 변경한 후 생산 결과에 큰 차이가 나타났다면, 일반적인 DNA 순도뿐 아니라 ITR 무결성도 반드시 확인 항목에 포함해야 합니다.

5. 플라스미드 구조와 DNA 무결성을 확인해야 하는 이유

플라스미드 DNA는 일반적으로 초나선형（Supercoiled）, 개환형（Open circular）, 선형（Linear） 등 여러 구조적 형태로 존재할 수 있습니다.

일시적 형질도입에 사용하는 플라스미드에서는 DNA의 구조적 상태도 품질 평가의 중요한 부분입니다. 플라스미드에 심각한 분해, 절단 또는 구조적 이상이 발생하면 형질도입 특성에 영향을 줄 수 있습니다.

다만 “초나선형 DNA의 비율이 높을수록 AAV 역가가 반드시 높아진다”고 단순하게 판단해서는 안 됩니다.

AAV 생산 결과는 플라스미드 구조뿐 아니라 세포 상태, 형질도입 효율, 사용 벡터 등 여러 요인의 영향을 받습니다.

따라서 플라스미드 구조를 평가할 때는 DNA 무결성, 형질도입 효율 및 실제 AAV 생산 결과를 함께 비교하는 것이 중요합니다.

예를 들어 특정 플라스미드 로트에서 구조나 무결성에 뚜렷한 차이가 나타나고 동시에 AAV 생산량도 감소했다면, 플라스미드 품질과의 연관성을 추가로 조사할 필요가 있습니다.

6. 플라스미드 순도가 정상인데도 AAV 역가가 낮아지는 이유

AAV 생산 과정에서는 플라스미드의 농도와 순도에 뚜렷한 이상이 없는데도 AAV 역가가 낮아지는 경우가 있습니다.

이러한 경우 문제의 원인을 플라스미드에만 한정해서는 안 됩니다. 다음과 같은 요인도 함께 확인해야 합니다.

6.1 생산 세포 상태

HEK293 세포 및 그 유래 세포의 상태는 일시적 형질도입과 AAV 생산에 직접적인 영향을 미칩니다.

세포 생존율, 세포 밀도, 증식 상태, 배양 조건 등이 변하면 형질도입 효율과 AAV 생산량이 달라질 수 있습니다.

6.2 형질도입 효율

AAV 일시적 형질도입 생산에서는 여러 플라스미드가 동일한 생산 세포 집단에 효율적으로 도입되어야 합니다.

전체 형질도입 효율이 감소하거나 각 플라스미드의 도입 효율에 차이가 발생하면 AAV 생산에 영향을 줄 수 있습니다.

따라서 플라스미드 품질이 정상이라고 해서 형질도입 과정에 문제가 없다고 판단할 수는 없습니다.

6.3 플라스미드 사용 비율

여러 플라스미드를 사용하는 AAV 생산 시스템에서는 각각의 플라스미드가 서로 다른 기능을 담당합니다.

트랜스퍼 플라스미드, Rep/Cap 플라스미드 및 헬퍼 플라스미드의 상대적인 사용 비율이 크게 달라지면 AAV 생산 효율에 영향을 줄 수 있습니다.

따라서 실험 결과를 비교할 때는 총 DNA 투입량뿐 아니라 각 플라스미드의 사용량과 비율도 확인해야 합니다.

6.4 AAV 혈청형

AAV는 혈청형에 따라 생산 특성이 다를 수 있습니다.

따라서 AAV 생산량을 비교할 때는 가능한 한 동일한 혈청형, 유사한 벡터 구조 및 동일한 생산 조건을 기준으로 비교하는 것이 중요합니다.

서로 다른 혈청형의 과거 생산 결과를 다른 혈청형의 평가 기준으로 그대로 사용하는 것은 적절하지 않습니다.

6.5 벡터 게놈 크기와 구조

AAV는 벡터 게놈을 패키징할 수 있는 크기에 제한이 있습니다.

벡터 게놈의 크기가 커질수록 패키징 효율이나 게놈 무결성에 영향을 받을 가능성이 있습니다. 특히 AAV의 유효 패키징 용량에 가까운 크기이거나 이를 초과하는 설계에서는 주의가 필요합니다.

따라서 플라스미드와 생산 조건에 뚜렷한 이상이 없는데도 특정 벡터에서 낮은 역가가 반복된다면 벡터 게놈 전체의 길이와 발현 카세트 설계를 확인해야 합니다.

또한 GOI, 프로모터, PolyA 등의 구성도 벡터별 생산 특성에 영향을 줄 수 있습니다.

6.6 정제 회수 및 역가 측정

최종 제품에서 측정된 AAV 역가는 생산 단계에서 실제로 생성된 AAV 입자 수와 반드시 일치하는 것은 아닙니다.

회수, 세포 용해, 뉴클레아제 처리, 정제, 농축, 여과 및 보관 과정에서 일정한 손실이 발생할 수 있습니다.

또한 “AAV 역가”가 어떤 지표를 의미하는지도 중요합니다. 게놈 역가, 입자 수, 감염성 역가 및 기능성 역가는 서로 다른 특성을 나타내는 지표이므로 동일하게 취급해서는 안 됩니다.

생산 단계에서는 문제가 없어 보이는데 최종 시료의 역가가 낮아졌다면, 문제가 생산, 정제·회수 또는 역가 측정 중 어느 단계에서 발생했는지 구분해서 확인해야 합니다.

7. AAV 저역가 발생 시 플라스미드 문제를 어떻게 확인할까요?

플라스미드 품질이 AAV 저역가의 원인으로 의심된다면 현재 로트를 과거의 정상 로트와 비교하는 것이 도움이 됩니다.

하나의 검사 항목만으로 판단하기보다는 다음 항목을 종합적으로 확인하는 것이 좋습니다.

① DNA 농도와 순도 확인

DNA 농도 측정이 적절하게 이루어졌는지 확인하고, A260/A280 및 A260/A230 등의 지표에 뚜렷한 이상이 없는지 확인합니다.

② DNA 무결성 확인

플라스미드에 심각한 분해, 절단 또는 기타 구조적 이상이 있는지 확인합니다.

③ 엔도톡신 수준 확인

세포 실험, 동물 실험 및 높은 품질 요구사항이 적용되는 프로젝트에서는 플라스미드 내 엔도톡신 수준을 중요한 품질 관리 항목으로 확인합니다.

④ 플라스미드 구조 확인

필요한 경우 서로 다른 로트 간 초나선형, 개환형 및 선형 DNA의 비율을 비교합니다.

⑤ 플라스미드 서열 확인

GOI, 프로모터, PolyA 등 핵심 기능 서열이 설계와 일치하는지 확인합니다.

⑥ AAV 트랜스퍼 플라스미드의 ITR 확인

일반적인 순도 지표에 이상이 없는데도 로트 간 AAV 생산 결과에 큰 차이가 있다면 ITR 무결성을 중점적으로 확인해야 합니다.

⑦ 형질도입 결과와 함께 분석

플라스미드 품질에 뚜렷한 이상이 없는데 형질도입 효율이 감소했다면 세포 상태, DNA 사용량, 형질도입 시약 및 작업 조건 등을 추가로 확인해야 합니다.

이처럼 플라스미드 검사 결과를 실제 형질도입 및 AAV 생산 결과와 함께 비교하면 저역가의 원인을 보다 효율적으로 구분할 수 있습니다.

8. 플라스미드 품질과 AAV 역가의 관계를 어떻게 이해해야 할까요?

AAV 생산에서 플라스미드 품질과 AAV 역가 사이에는 단순한 선형 관계가 존재하는 것은 아닙니다.

보다 정확하게 말하면, 고품질 플라스미드는 안정적인 AAV 생산 결과를 얻기 위한 중요한 기반이지만, 최종 AAV 역가를 단독으로 결정하지는 않습니다.

플라스미드 순도, 엔도톡신, DNA 무결성, 플라스미드 구조 및 ITR 무결성은 생산 원료로서 플라스미드 품질을 구성하는 중요한 요소입니다.

한편 생산 세포 상태, 형질도입 효율, 플라스미드 비율, AAV 혈청형, 벡터 게놈 크기, 생산 공정, 정제 회수율 및 역가 측정 방법도 최종 AAV 역가에 영향을 줄 수 있습니다.

따라서 AAV 역가가 낮아지거나 로트 간 재현성이 좋지 않은 경우에는 생산 공정 전체를 다음과 같이 구분하여 확인하는 것이 중요합니다.

플라스미드 품질 → 세포 상태 → 형질도입 과정 → AAV 생산 → 정제·회수 → 역가 측정

각 공정을 비교하고 검증하면 실제 원인을 보다 효율적으로 파악할 수 있습니다.

결론

AAV 플라스미드의 순도는 바이러스 생산량에 영향을 줄 수 있지만, AAV 저역가의 원인을 플라스미드 순도만으로 설명할 수는 없습니다.

AAV 트랜스퍼 플라스미드에서는 DNA 농도와 일반적인 순도 지표뿐 아니라 DNA 무결성, 플라스미드 구조, 엔도톡신, 특히 ITR 무결성을 확인하는 것이 중요합니다.

이러한 항목에 뚜렷한 이상이 없다면 생산 세포 상태, 형질도입 효율, 플라스미드 비율, AAV 혈청형, 벡터 게놈 크기, 그리고 이후의 정제·회수 및 역가 측정 과정을 추가로 검토해야 합니다.

안정적인 AAV 생산량과 로트 간 일관성을 확보하기 위해서는 충분한 품질 관리를 거친 고품질 플라스미드를 사용하는 것이 중요합니다. 다만 최종 AAV 역가는 생산 공정 전체를 종합적으로 평가해야 합니다.