AAV 패키징 용량이란? 4.7 kb를 초과하면 어떻게 될까?

AAV(Adeno-Associated Virus, 아데노연관바이러스) 벡터는 유전자 과발현, 유전자 편집, 동물 모델 구축 및 유전자 치료 연구 등 다양한 분야에서 활용되고 있습니다. 하지만 AAV가 패키징할 수 있는 유전체의 크기에는 한계가 있습니다.

AAV 벡터의 유전체 크기가 지나치게 커지면 바이러스 생산뿐만 아니라 패키징된 유전체의 완전성과 이후 목적 유전자의 발현에도 영향을 줄 수 있습니다.

그렇다면 AAV의 패키징 용량은 어느 정도이며, 일반적인 용량 범위를 초과하면 어떤 문제가 발생할 수 있을까요?

AAV의 패키징 용량은 어느 정도인가?

AAV의 천연 유전체는 약 4.7 kb이므로, 재조합 AAV(rAAV) 벡터를 설계할 때 약 4.7 kb를 일반적인 패키징 용량의 중요한 기준으로 활용합니다.

여기서 말하는 4.7 kb는 GOI(Gene of Interest, 목적 유전자) 자체의 크기를 의미하는 것이 아닙니다. 두 개의 ITR(Inverted Terminal Repeat, 역말단반복서열) 사이에 존재하는 전체 벡터 유전체의 길이를 의미합니다.

일반적인 AAV 발현 벡터에는 다음과 같은 서열이 포함될 수 있습니다.

• 프로모터(Promoter)
• GOI
• 조절 요소
• poly(A) 신호
• 기타 기능성 서열

이러한 서열은 모두 AAV 벡터 유전체의 전체 길이에 포함됩니다.

따라서 GOI가 3 kb라고 하더라도 프로모터, poly(A) 신호 및 기타 조절 서열을 추가하면 전체 벡터의 길이가 AAV의 적정 패키징 범위를 초과할 수 있습니다.

AAV 패키징 용량을 초과하면 어떤 영향이 있을까?

1. 패키징 효율이 저하될 수 있습니다

AAV 벡터 유전체의 크기가 일반적인 패키징 범위에 가까워지거나 이를 초과하면 바이러스 생산 과정에서 패키징 효율에 영향을 줄 수 있습니다.

다만 4.7 kb가 ‘이 길이를 넘으면 패키징할 수 없다’는 절대적인 상한선은 아닙니다.

4.7 kb를 약간 초과하는 벡터에서도 일정량의 AAV가 생성될 수 있습니다. 하지만 벡터 유전체의 크기가 더 커질수록 완전한 길이의 유전체가 패키징되는 비율과 패키징 효율에 더 큰 영향을 줄 가능성이 있습니다.

따라서 AAV 벡터를 설계할 때는 단순히 “4.7 kb를 넘으면 패키징이 불가능하다”고 판단하기보다는, 벡터 크기가 증가하면서 패키징 효율과 유전체 완전성에 어떤 영향을 미치는지 평가하는 것이 중요합니다.

2. 완전한 길이의 유전체 비율이 감소할 수 있습니다

벡터 유전체가 지나치게 큰 경우 AAV 캡시드 내부에 절단되거나 불완전한 벡터 유전체가 패키징되는 비율이 증가할 수 있습니다.

따라서 용량을 초과한 AAV 벡터에서는 최종적으로 측정되는 바이러스 유전체 역가가 비교적 높더라도, 추가 분석을 진행하면 완전한 길이의 유전체 비율이 충분하지 않을 수 있습니다.

특히 이러한 경우 vg/mL만 측정해서는 AAV 제제에 포함된 완전한 기능성 벡터 유전체의 비율을 충분히 평가하기 어렵습니다.

3. 유전체의 이질성이 증가할 수 있습니다

발현 카세트의 크기가 AAV의 적정 패키징 범위를 크게 초과하면 패키징되는 유전체의 길이에 차이가 발생하고, 다양한 형태의 절단된 유전체가 포함될 가능성이 있습니다.

이로 인해 AAV 제제 내 유전체 구성의 복잡성이 증가하고, 이후 품질 평가에도 영향을 줄 수 있습니다.

특히 완전한 길이의 벡터 유전체가 중요한 연구에서는 총 유전체 역가뿐만 아니라 유전체 완전성(genome integrity)도 함께 평가하는 것이 중요합니다.

4. 목적 유전자의 발현에 영향을 줄 수 있습니다

AAV 벡터의 크기가 지나치게 커지면 완전한 발현 카세트를 포함하는 벡터 유전체의 비율이 감소할 수 있습니다.

세포에 전달된 AAV 유전체의 일부에 결실이나 절단이 발생한 경우 완전한 기능성 발현 카세트를 형성하지 못할 수 있으며, 그 결과 목적 유전자의 발현 수준이나 형질도입 후 기능적 효과에 영향을 줄 수 있습니다.

실험에서는 다음과 같은 현상이 나타날 수 있습니다.

AAV 유전체 역가는 높지만 목적 유전자의 발현 수준은 낮은 경우

이러한 상황에서는 프로모터, GOI, AAV 혈청형 및 실험 조건뿐만 아니라 벡터 크기가 지나치게 크지 않은지, 유전체 완전성에 문제가 없는지도 함께 확인할 수 있습니다.

qPCR 또는 ddPCR에서는 역가가 정상인데 발현이 낮은 이유는?

이는 AAV 벡터 설계 및 품질 평가에서 자주 발생하는 오해 중 하나입니다.

qPCR 또는 ddPCR은 일반적으로 벡터 유전체의 특정 서열을 표적으로 검출합니다. 따라서 측정 결과로 얻은 AAV 유전체 역가는 검출 대상 서열의 존재량을 반영하는 값이며, 벡터 유전체 전체가 완전한 상태라는 것을 단독으로 증명하는 것은 아닙니다.

예를 들어, 크기가 큰 AAV 발현 카세트의 일부가 절단되었더라도 qPCR/ddPCR의 표적 영역이 유지되어 있다면 비교적 높은 유전체 역가로 검출될 수 있습니다. 그러나 해당 유전체가 GOI와 필요한 조절 서열을 모두 포함하고 있다고 단정할 수는 없습니다.

즉,

높은 vg/mL가 반드시 높은 비율의 완전한 길이의 기능성 AAV 유전체를 의미하는 것은 아닙니다.

따라서 AAV 유전체 역가는 충분하지만 목적 유전자의 발현이 낮은 경우, 특히 벡터 크기가 큰 경우에는 유전체 완전성도 함께 검토할 필요가 있습니다.

물론 발현 저하의 원인이 벡터 크기에만 있는 것은 아닙니다. 프로모터, GOI, AAV 혈청형, 표적 세포 및 투여 조건 등 여러 요인을 종합적으로 평가해야 합니다.

AAV 벡터가 패키징 용량을 초과했는지 어떻게 판단할까?

AAV 벡터의 크기를 평가할 때는 두 개의 ITR 사이에 존재하는 전체 벡터 유전체의 길이를 계산해야 합니다.

일반적으로 다음과 같은 서열을 포함해 계산합니다.

프로모터 + GOI + 조절 요소 + poly(A) + 기타 ITR 사이의 서열

여기서 중요한 점은 GOI의 크기만으로 AAV의 패키징 용량을 판단해서는 안 된다는 것입니다.

예를 들어 4 kb의 GOI가 있더라도 프로모터, poly(A) 신호 및 기타 조절 서열을 추가하면 실제 ITR-to-ITR 크기는 4 kb를 크게 초과할 수 있습니다.

따라서 AAV 프로젝트에서는 바이러스 패키징을 시작하기 전에 벡터 전체의 크기를 확인하는 것이 좋습니다.

AAV 용량을 초과하는 경우 어떻게 대응할 수 있을까?

GOI가 큰 경우에는 먼저 발현 카세트의 구성을 검토할 수 있습니다.

프로모터와 조절 요소를 최적화

연구 목적에 따라 보다 컴팩트한 프로모터 또는 조절 요소를 선택하면 벡터 전체의 크기를 줄일 수 있는 경우가 있습니다.

다만 서열을 단순히 줄이면 발현 수준, 조직 특이성 또는 발현 지속성에 영향을 줄 수 있으므로 연구 목적에 맞는 설계가 필요합니다.

불필요한 서열을 줄이기

벡터 내 기능적으로 필요하지 않은 서열이 있다면 벡터의 설계 목적과 기능을 유지하는 범위에서 해당 서열을 줄여 GOI에 사용할 수 있는 공간을 확보할 수 있습니다.

Dual AAV를 고려

GOI가 크고 하나의 AAV 벡터에 완전한 발현 카세트를 탑재하기 어려운 경우에는 Dual AAV(듀얼 AAV) 전략을 고려할 수 있습니다.

Dual AAV는 큰 발현 카세트를 두 개의 AAV 벡터로 나누고, 중복 서열(overlapping sequences), trans-splicing(트랜스 스플라이싱) 등의 설계를 이용하여 동일한 세포 내에서 보다 큰 기능성 발현 카세트를 재구성하는 방식입니다.

다만 Dual AAV는 단순히 유전자를 두 부분으로 나누어 각각 패키징하는 방법은 아닙니다. 벡터 설계, 두 AAV가 동일한 세포에 함께 전달되는 효율, 세포 내 재구성 효율 등 여러 요인이 최종 결과에 영향을 미칩니다.

4.7 kb는 AAV의 절대적인 패키징 상한선인가?

4.7 kb를 AAV의 절대적인 패키징 상한선으로 보는 것은 적절하지 않습니다.

4.7 kb는 AAV의 천연 유전체 크기에 기반한 값으로, rAAV 벡터 설계에서 중요한 용량 기준입니다. 그러나 4.7 kb를 약간 초과하는 벡터에서도 일정량의 패키징 산물이 생성될 수 있습니다.

다만 벡터의 크기가 증가할수록 완전한 길이의 유전체 비율, 절단된 유전체, 유전체 완전성 및 최종적인 기능적 발현 등에 대한 평가가 더욱 중요해집니다.

즉, AAV 패키징 용량은 단순히 “4.7 kb 이하는 가능하고, 4.7 kb를 초과하면 불가능하다”고 판단하는 개념이 아닙니다. 벡터 크기가 증가함에 따라 패키징 효율과 유전체 완전성에 어떤 영향을 미치는지를 평가하는 것이 중요합니다.

AAV 벡터 설계 시 확인해야 할 사항

AAV 벡터의 크기는 패키징을 시작하기 전에 설계 단계에서 확인하는 것이 좋습니다.

먼저 GOI의 크기만 계산하지 말고 ITR-to-ITR 전체 길이를 확인해야 합니다.

또한 벡터 크기가 일반적인 AAV 용량 범위에 가까워지거나 이를 초과하는 경우에는 패키징 효율과 유전체 완전성에 미칠 영향을 고려해야 합니다.

큰 GOI를 탑재해야 한다면 발현 카세트를 보다 컴팩트하게 설계하거나, 필요한 경우 Dual AAV와 같은 전달 전략을 검토할 수 있습니다.

결론

AAV의 천연 유전체는 약 4.7 kb이며, 약 4.7 kb는 일반적인 rAAV 벡터 설계에서 중요한 패키징 용량의 기준입니다.

두 개의 ITR 사이에 위치하는 벡터 유전체가 지나치게 길어지면 패키징 효율 저하, 완전한 길이의 유전체 비율 감소, 절단 또는 불완전한 유전체 증가 등이 발생할 수 있습니다. 이러한 변화는 목적 유전자의 형질도입 및 발현에도 영향을 줄 수 있습니다.

반면 4.7 kb가 절대적인 패키징 상한선인 것은 아닙니다. 4.7 kb를 초과하는 벡터에서도 패키징 산물이 생성될 수 있지만, 벡터 크기가 증가할수록 유전체 완전성과 기능적 특성에 대한 평가가 중요해집니다.

따라서 AAV 벡터를 설계할 때는 GOI의 크기뿐만 아니라 두 개의 ITR 사이에 존재하는 전체 서열의 길이를 확인하는 것이 중요합니다. 큰 GOI를 사용하는 경우에는 발현 카세트 최적화 또는 Dual AAV 등의 전략을 검토할 수 있습니다.