AAV 벡터 설계에서 흔한 오류는? AAV 벡터 설계 시 주요 고려사항

AAV(Adeno-Associated Virus, 아데노연관바이러스) 벡터 설계는 이후의 바이러스 패키징과 목적 유전자 발현에 직접적인 영향을 미치는 중요한 단계입니다. 실제 연구에서는 특정 서열 하나의 오류보다는 벡터의 패키징 용량, 발현 요소, GOI(Gene of Interest, 목적 유전자) 및 실험 목적이 서로 적절하게 맞지 않아 문제가 발생하는 경우가 많습니다.

다음은 AAV 벡터를 설계할 때 자주 발생하는 문제입니다.

1. AAV 벡터의 패키징 용량을 고려하지 않는 경우

AAV의 유전체는 패키징할 수 있는 용량에 제한이 있습니다. 일반적인 재조합 AAV(rAAV) 벡터에서는 두 ITR 사이의 유전체 길이가 약 4.7 kb 범위라는 점을 중요한 기준으로 고려합니다. 벡터 크기가 이 범위에 가까워지거나 이를 초과하면 패키징 효율이 저하될 수 있으며, 불완전하거나 비정상적인 유전체가 생성될 가능성도 높아질 수 있습니다.

벡터 크기를 계산할 때는 GOI의 길이만 확인해서는 안 됩니다. 두 ITR 사이에 존재하는 전체 서열을 계산해야 하며, 여기에는 프로모터, 인핸서, GOI, WPRE, poly(A) 및 기타 조절 서열이 포함됩니다.

따라서 AAV 벡터를 설계할 때는 먼저 전체 발현 카세트의 크기를 확인하고, 필요하지 않은 조절 요소를 줄이거나 전체 벡터 구조를 조정하는 것이 좋습니다.

2. ITR 서열에 문제가 있는 경우

ITR(Inverted Terminal Repeat, 역말단반복서열)은 AAV 벡터의 중요한 cis-acting element로, AAV 유전체의 복제 및 패키징 과정에 중요한 역할을 합니다.

ITR은 특유의 2차 구조를 가지고 있어 플라스미드 구축 및 증폭 과정에서 상대적으로 불안정할 수 있습니다. 대표적인 문제로는 ITR의 돌연변이, 결실 또는 재배열 등이 있습니다.

따라서 AAV 플라스미드의 품질을 확인할 때는 GOI의 서열만 확인해서는 충분하지 않습니다. 벡터의 특성에 따라 ITR 관련 영역도 적절한 방법으로 확인하는 것이 필요합니다.

3. 실험 목적에 적합하지 않은 프로모터를 선택하는 경우

프로모터는 GOI의 전사 및 발현 특성을 결정하는 핵심 요소입니다.

높은 발현을 얻기 위해 강한 구성적 프로모터를 선택하는 경우가 있지만, 강한 프로모터가 항상 모든 실험에 적합한 것은 아닙니다. 특정 조직이나 세포에서 선택적으로 GOI를 발현시키려는 경우, 조직 또는 세포 특이성이 낮은 프로모터를 사용하면 비표적 조직에서도 발현이 나타날 수 있습니다.

프로모터를 선택할 때는 다음과 같은 요소를 함께 고려해야 합니다.

• 표적 조직
• 표적 세포
• 동물 종
• 투여 경로
• 원하는 발현 수준
• 체내 또는 체외 적용 여부

조직 또는 세포 특이적인 발현이 필요한 경우에는 해당 목적에 적합한 특이적 프로모터 또는 조절 요소를 고려하는 것이 좋습니다.

4. GOI의 길이만 계산하고 전체 벡터 길이를 확인하지 않는 경우

AAV 벡터 설계에서 자주 놓치는 부분 중 하나입니다.

예를 들어 일반적인 발현 카세트는 다음과 같이 구성될 수 있습니다.

Promoter + GOI + WPRE + poly(A)

GOI 자체의 길이가 AAV의 일반적인 패키징 범위를 초과하지 않더라도 프로모터, WPRE, poly(A) 등의 요소를 추가하면 전체 벡터 길이가 크게 증가할 수 있습니다.

따라서 AAV 벡터를 설계할 때는 GOI가 몇 kb인지에만 집중하지 말고, 두 ITR 사이에 포함되는 전체 서열의 길이를 기준으로 평가해야 합니다.

GOI가 큰 경우에는 프로젝트 목적에 따라 더 작은 프로모터를 선택하거나 불필요한 조절 요소를 줄이는 등의 방법으로 벡터 구조를 조정할 수 있습니다.

5. GOI 서열을 충분히 검토하지 않는 경우

GOI가 벡터에 정확하게 삽입되었다고 해서 반드시 AAV에서 원하는 수준으로 발현되는 것은 아닙니다.

GOI의 길이, GC 함량, 반복 서열 및 플라스미드 안정성이나 발현에 영향을 줄 수 있는 서열 특성을 검토할 필요가 있습니다. 일부 유전자의 경우에는 코돈 최적화나 잠재적인 비정상적 스플라이싱 가능성도 고려할 수 있습니다.

다만 코돈 최적화가 모든 AAV 프로젝트에서 반드시 필요한 것은 아닙니다. 실제 적용 여부는 대상 종, GOI의 서열 특성 및 발현 목적 등을 종합적으로 판단해야 합니다.

6. 다중 유전자 발현 설계가 적절하지 않은 경우

하나의 AAV 벡터에서 두 개 이상의 유전자를 동시에 발현하려는 경우에는 발현 전략을 사전에 결정해야 합니다.

대표적인 방법으로는 다음과 같은 방식이 있습니다.

• 이중 프로모터
• IRES
• 2A peptide
• 각각 독립적인 RNA 발현 시스템을 사용하는 방식

각 방법은 벡터 크기, 단백질 발현 수준 및 각 유전자 간 발현 관계에 영향을 줄 수 있습니다.

예를 들어 이중 프로모터를 사용하면 서로 다른 유전자를 독립적으로 조절할 수 있지만 벡터의 전체 크기가 증가합니다. 2A peptide를 사용하면 하나의 발현 카세트에서 여러 단백질을 발현할 수 있지만, 각각 독립적인 발현 카세트를 사용하는 경우와 완전히 동일한 발현 특성을 갖는 것은 아닙니다.

따라서 다중 유전자 AAV 벡터는 단순히 여러 발현 요소를 연결하기보다는 발현 목적과 벡터의 패키징 용량을 함께 고려하여 설계해야 합니다.

7. AAV 캡시드와 프로모터를 함께 고려하지 않는 경우

AAV의 체내 발현 결과는 캡시드 하나만으로 결정되지 않습니다.

AAV 캡시드는 세포 진입과 조직 분포 등에 영향을 미치며, 프로모터는 세포 내에서의 유전자 발현 특성에 영향을 줍니다. 이와 함께 동물 종, 투여 경로 및 투여량 등도 최종 결과에 영향을 줄 수 있습니다.

따라서 특정 문헌에서 특정 AAV 혈청형이 좋은 결과를 보였다는 이유만으로 동일한 혈청형을 그대로 적용하는 것은 적절하지 않을 수 있습니다.

실제 AAV 벡터를 설계할 때는 다음 요소를 함께 고려하는 것이 좋습니다.

동물 종 + 투여 경로 + 표적 조직 + 표적 세포 + AAV 캡시드 + 프로모터

동일한 AAV 캡시드라도 동물 종이나 투여 경로가 달라지면 조직 분포와 발현 결과가 달라질 수 있습니다.

8. RNA 발현 벡터를 적절하게 설계하지 않는 경우

AAV를 shRNA, miRNA 등의 RNA 발현에 사용하는 경우에는 표적 서열뿐만 아니라 RNA의 발현 및 가공 방식도 고려해야 합니다.

예를 들어 shRNA 또는 miRNA 벡터에서는 표적 서열, 프로모터, RNA 가공 과정 및 잠재적인 off-target effect 등을 종합적으로 검토할 필요가 있습니다.

따라서 단순히 표적 유전자의 일부 서열을 AAV 벡터에 삽입하는 것만으로 원하는 수준의 유전자 억제가 보장되는 것은 아닙니다.

9. CRISPR 관련 AAV 벡터에서 패키징 용량을 충분히 고려하지 않는 경우

AAV를 CRISPR 유전자 편집에 사용할 경우에는 벡터의 패키징 용량을 설계 단계에서 특히 주의해야 합니다.

하나의 AAV 벡터에 Cas 단백질 발현 카세트와 sgRNA 발현 요소를 모두 포함하려는 경우, Cas 단백질의 크기 자체가 상당한 공간을 차지할 수 있습니다. 여기에 프로모터, poly(A) 등의 요소가 추가되면 전체 벡터가 AAV의 패키징 용량에 가까워질 수 있습니다.

따라서 CRISPR 관련 AAV 벡터는 프로젝트 초기부터 전체 길이를 계산하는 것이 좋습니다. Cas 시스템의 크기가 큰 경우에는 연구 목적에 따라 dual-AAV와 같은 전략을 고려할 수도 있습니다.

10. 대조군 벡터를 사전에 계획하지 않는 경우

AAV를 이용한 세포 및 동물 실험에서는 대조군 설계도 중요합니다.

예를 들어 유전자 과발현 실험에서는 연구 목적에 맞는 음성 대조군 또는 empty vector 대조군을 사용할 수 있으며, 유전자 억제 실험에서는 non-targeting shRNA 대조군을 사용할 수 있습니다. CRISPR 실험에서는 일반적으로 적절한 non-targeting sgRNA 대조군 등을 고려할 수 있습니다.

어떤 대조군을 사용할지는 실험 목적과 연구 시스템에 따라 달라지므로 모든 AAV 실험에 동일한 대조군을 적용하는 것은 적절하지 않습니다.

11. 패키징 전에 플라스미드 서열을 충분히 확인하지 않는 경우

AAV 패키징 전에 사용되는 플라스미드의 서열을 확인하는 것은 중요한 품질관리 단계입니다.

GOI뿐만 아니라 프로모터, 발현 카세트, 연결 부위 및 기타 주요 구성 요소가 설계와 일치하는지 확인해야 합니다. ITR 역시 벡터의 특성에 따라 무결성과 구조적 이상 여부를 적절히 확인할 필요가 있습니다.

플라스미드 자체에 서열 오류가 있다면 이후 AAV 패키징이 정상적으로 진행되어 높은 바이러스 역가를 얻더라도 벡터 자체의 오류를 해결할 수 없습니다.

따라서 AAV 패키징 전에 벡터 구조에 맞는 적절한 확인 및 시퀀싱 방법을 적용하여 주요 영역을 검증하는 것이 좋습니다.

AAV 벡터 설계 시 확인해야 할 사항

AAV 벡터 설계를 완료한 후에는 다음 항목을 확인하는 것이 좋습니다.

벡터 크기: 두 ITR 사이의 전체 서열 길이가 AAV의 패키징 특성을 고려했을 때 적절한지 확인합니다.

ITR: ITR의 서열과 구조가 설계에 맞는지 확인하고, 플라스미드 증폭 과정에서 이상이 발생하지 않았는지 검토합니다.

발현 카세트: Promoter, GOI, WPRE, poly(A) 등의 위치와 방향이 올바른지 확인합니다.

GOI: 서열과 ORF가 정확한지 확인하고, 길이 및 서열 특성이 발현 목적에 적합한지 검토합니다.

조직 특이성: AAV 캡시드와 프로모터가 표적 조직, 표적 세포 및 동물 모델에 적합한지 확인합니다.

다중 유전자 또는 유전자 편집: 전체 패키징 용량과 발현 전략을 사전에 검토합니다.

대조군: 실험 목적에 맞는 음성 대조군 및 기타 필요한 대조군을 설계합니다.

플라스미드 품질: AAV 패키징 전에 필요한 플라스미드 확인 및 시퀀싱을 완료합니다.

결론

AAV 벡터 설계에서 흔히 발생하는 문제는 벡터 크기, ITR 안정성, 프로모터 선택, GOI 설계, 다중 유전자 발현 전략 및 AAV 캡시드와 실험 모델의 적합성과 관련되어 있습니다.

특히 설계 단계에서는 두 ITR 사이의 전체 길이와 ITR의 무결성을 확인하는 것이 중요합니다. 동물실험에 사용하는 경우에는 동물 종, 투여 경로, 표적 조직 및 표적 세포까지 함께 고려하여 AAV 캡시드와 프로모터를 선택해야 합니다.

AAV 벡터는 제한된 패키징 용량 안에서 필요한 발현 기능을 구현해야 하므로, 불필요한 서열을 줄이고 실험 목적에 맞는 구조로 설계하는 것이 중요합니다. 또한 벡터 설계가 완료된 후에는 적절한 플라스미드 검증과 시퀀싱을 통해 실제 구축된 플라스미드가 설계와 일치하는지 확인하는 것이 좋습니다.