AAV 바이러스 패키징 자주 묻는 질문(FAQ)

1. AAV 패키징에는 어떤 기본 구성 요소가 필요한가?

일반적으로 사용되는 3-플라스미드 시스템은 다음과 같다:

1. 전달 플라스미드(Transfer plasmid): ITR 서열과 목적 유전자 발현 카세트 포함

2. 헬퍼 플라스미드(Helper plasmid): AAV 패키징에 필요한 아데노바이러스 보조 유전자(E2A, E4, VA 등) 제공

3. 캡시드 플라스미드(Capsid plasmid): AAV 혈청형(AAV2, AAV8, AAV9, PHP.eB 등)을 결정

일부 시스템은 2-플라스미드 또는 4-플라스미드 방식도 존재하나 기본 원리는 동일하다.

2. AAV 패키징에 어떤 세포주를 사용하는가? 반드시 HEK293T여야 하나?

가장 흔히 사용되는 세포주는 HEK293T 또는 HEK293이다.
이유: 두 세포주는 아데노바이러스 E1 유전자를 발현하여 AAV 생산에 필요한 일부 보조 기능을 제공하기 때문이다.
다른 세포주는 생산 효율이 떨어져 권장되지 않는다.

3. AAV 패키징의 기본 절차는 어떻게 되는가?

일반적인 패키징 절차:
① HEK293T 세포 배양(70–90% confluency)
② 3종 플라스미드 공동 전송(transfection)
③ 48–72시간 후 세포 및 상층액 수집
④ 세포 파쇄(Freeze–thaw 또는 Benzonase 처리)
⑤ 정제(Iodixanol gradient, CsCl, affinity column 등)
⑥ 바이러스 역가 측정(qPCR 또는 ddPCR)

4. AAV가 포장할 수 있는 유전자 크기 제한은?

AAV의 최대 패키징 용량은 약 4.7 kb이며, 실제로는 각종 조절 요소를 포함하여 4.4 kb 이하가 이상적이다.
초과 시 역가 감소 및 감염 효율 저하가 발생한다.

큰 유전자는 다음을 이용해 해결할 수 있다:

• Dual-AAV 시스템 (Overlap, Trans-splicing 등)

5. AAV 역가가 낮게 나오는 이유는?

주요 원인:

• ITR 구조 손상

• 세포 상태 불량(과밀/과소 배양)

• 전송 효율 저하

• Benzonase 미사용으로 인한 유리 DNA 오염

• 목적 유전자의 세포 독성

• 특정 혈청형의 패키징 효율이 본래 낮음

6. AAV 정제 방식은 어떤 차이가 있는가?

7. AAV의 빈 캡시드(empty)와 가득 찬(full) 캡시드를 어떻게 평가하는가?

평가 방법:

• AUC(Analytical ultracentrifugation)

• TEM(Transmission electron microscopy)

• Dot blot + Protein blot 비율

• qPCR/ELISA를 통한 vg:vp 비율 계산

빈 캡시드가 많으면 감염 효율이 낮아질 수 있다.

8. AAV는 어떻게 보관해야 하는가? 동결·해동해도 되는가?

권장 조건:

• -80°C 장기 보관

• 반복된 freeze–thaw 금지

• 바이러스 손실 방지를 위해 0.001–0.05% Pluronic F68 또는 0.1% BSA 첨가 가능

AAV는 -80°C에서 가장 안정하며, 4°C는 단기 보관용(1–2주)으로 적합하다.

9. AAV 역가 단위는 무엇인가? vg/mL의 의미는?

vg/mL (vector genomes per milliliter)
→ 1 mL에 포함된 AAV 유전체(genome) 개수를 의미하며 qPCR 또는 ddPCR로 측정한다.

중요:

• vg는 감염 단위가 아님

• AAV는 복제가 불가능하므로 TU/mL 측정은 부정확함

10. AAV 감염 효율이 낮은 이유는?

가능한 원인:

• 세포 유형이 특정 혈청형과 잘 맞지 않음

• 혈청형 선택 부적절

• 목적 유전자 독성

• 역가 부족 또는 빈 캡시드 비율 높음

• 세포 상태 불량

• 감염 조건 미흡(첨가물 없음 등)