석·박사 연구자 및 PI 필독｜연구용 마우스부터 임상시험계획(IND) 신청까지: AAV 유전자치료제 개발 전 과정 알아보기

최근 아데노연관바이러스(Adeno-Associated Virus, AAV) 벡터는 상대적으로 낮은 병원성, 다양한 조직으로의 유전자 전달 가능성 및 장기간의 체내 유전자 발현 특성으로 인해 유전자치료 연구와 임상 개발 분야에서 주목받고 있습니다.

실험실에서의 세포 형질도입부터 연구용 마우스에서의 유전자 발현 검증, 비임상 연구, GMP 생산 및 IND 신청에 이르기까지 AAV 벡터 개발은 단순한 바이러스 패키징 과정이 아닙니다. 벡터 설계, 제조공정 개발, 품질관리, 약효 평가 및 규제 관련 자료 준비가 유기적으로 연결된 종합적인 개발 과정입니다.

AAV 연구를 수행하는 석·박사 과정 연구자, 연구책임자(PI), 유전자치료제 개발 담당자라면 전체 개발 경로를 이해하는 것이 중요합니다. 초기 연구 단계부터 향후 개발 가능성을 고려하면 실험 설계와 기술적 의사결정에 도움이 될 수 있습니다.

그렇다면 하나의 AAV 프로젝트는 어떤 단계를 거치며, 연구용 AAV는 어떻게 임상 개발 단계로 발전할 수 있을까요?

1단계: 연구 목표 설정 및 AAV 벡터 설계

모든 AAV 프로젝트는 명확한 연구 목표 설정에서 시작됩니다.

바이러스 패키징에 앞서 목적 유전자(Gene of Interest, GOI), 표적 조직, 발현 방식 및 연구의 최종 평가 지표를 결정해야 합니다.

대표적인 AAV 연구 목적은 다음과 같습니다.

• 유전자 과발현(Overexpression): AAV 벡터를 이용해 목적 유전자를 발현시켜 유전자 기능이나 관련 생물학적 기전을 연구합니다.
• 유전자 발현 억제(Knockdown): shRNA 등의 발현 요소를 이용해 표적 유전자의 발현 수준을 낮춥니다.
• 유전자 기능 상실(Knockout): CRISPR 등의 유전자 편집 시스템을 이용해 표적 유전자의 기능을 억제하거나 상실시킵니다.
• 형광 표지(Fluorescent Labeling): GFP, mCherry 등의 리포터 유전자를 이용해 세포 또는 조직에서의 발현을 관찰합니다.

연구 목적이 정해지면 AAV 벡터의 주요 구성 요소를 설계해야 합니다.

1. 혈청형 선택

AAV 혈청형 및 엔지니어링된 캡시드는 조직과 종에 따라 형질도입 특성이 달라질 수 있습니다.

대표적인 연구용 혈청형으로는 AAV2, AAV5, AAV8, AAV9 및 PHP.eB, PHP.S와 같은 엔지니어링 캡시드가 있습니다.

혈청형 선택 시 표적 조직, 동물 모델, 투여 경로 및 관련 문헌 근거를 종합적으로 고려해야 합니다. 특정 혈청형이 모든 실험 조건에서 가장 우수한 결과를 나타낸다고 일반화해서는 안 됩니다.

2. 프로모터 선택

프로모터는 목적 유전자의 발현 수준과 조직 또는 세포 유형에 따른 발현 특성에 영향을 줍니다.

대표적인 프로모터는 다음과 같습니다.

• CAG: 비교적 광범위한 유전자 발현에 사용됩니다.
• CMV: 다양한 세포에서의 유전자 발현에 활용됩니다.
• EF1α: 여러 세포 유형에서 발현을 유도하는 데 사용됩니다.
• hSyn: 신경세포 관련 발현 연구에 활용됩니다.
• GFAP: 성상교세포 관련 발현 연구에 활용됩니다.
• TBG: 간세포 관련 발현 연구에 활용됩니다.

다만 프로모터의 발현 특이성은 종, 조직, 벡터 구성 및 실험 조건에 따라 달라질 수 있습니다.

3. AAV 벡터 패키징 용량 평가

야생형 AAV의 게놈 크기는 약 4.7 kb이며, 재조합 AAV(rAAV)의 유효 패키징 용량 역시 게놈 구조와 완전성 요구사항의 영향을 받습니다.

벡터 설계 시 GOI의 길이만 계산해서는 안 됩니다. 프로모터, 조절 요소, 태그 서열, PolyA 등의 전체 발현 카세트 구성과 ITR 관련 구조도 함께 고려해야 합니다.

발현 카세트가 지나치게 크면 게놈 패키징의 완전성과 최종 제품의 품질에 영향을 줄 수 있으므로, 벡터 제작 전에 전체 서열 길이를 검토하는 것이 중요합니다.

이 단계의 핵심 목표는 연구 목적에 부합하고 서열 검증이 완료된 적절한 AAV 발현 벡터를 확보하는 것입니다.

2단계: AAV 바이러스 패키징 및 연구용 제품 생산

벡터 설계와 플라스미드 제작이 완료되면 AAV 패키징 단계로 진행합니다.

현재 HEK293 세포를 이용한 삼중 플라스미드 패키징 시스템은 재조합 AAV 생산에 널리 사용되는 방법 중 하나입니다.

일반적인 삼중 플라스미드 시스템은 다음과 같이 구성됩니다.

1. 전달 플라스미드(Transfer Plasmid): 목적 유전자와 발현 요소를 포함하며, 양쪽 끝에 ITR 서열이 위치합니다.
2. Rep/Cap 플라스미드: AAV 복제 관련 단백질과 캡시드 단백질을 제공합니다.
3. 헬퍼 플라스미드(Helper Plasmid): AAV 생산에 필요한 보조 바이러스 관련 기능을 제공합니다.

관련 구성 요소를 세포에 형질주입하면 HEK293 세포 내에서 각 요소가 상호작용하여 재조합 AAV 입자가 생산됩니다.

이후 바이러스 수확, 세포 용해, 정제, 농축 및 버퍼 교환 등의 공정을 거쳐 연구용 AAV 제품을 확보합니다.

연구자는 이 단계에서 최종 역가뿐 아니라 다음 사항도 확인해야 합니다.

• 바이러스 생산량이 실험 요구량을 충족하는가?
• 게놈의 완전성이 적절한가?
• 바이러스 순도와 불순물 잔류 수준은 어떠한가?
• 생산 배치 간 품질 비교가 가능한가?
• 보관 및 동결·해동 과정이 제품 품질에 영향을 미치는가?

연구용 AAV는 주로 기초 연구, 세포 실험 및 동물 모델 검증에 활용됩니다. 프로젝트가 임상 개발 단계로 진행되면 제조공정과 품질관리 요구사항도 더욱 체계적으로 확립해야 합니다.

3단계: AAV 품질시험 및 연구 적합성 평가

AAV 제품을 수령했다고 해서 바로 동물실험에 사용할 수 있는 것은 아닙니다.

실제 사용에 앞서 연구 목적에 맞는 품질시험을 수행해야 합니다.

1. 게놈 역가 측정

대표적인 측정 방법에는 qPCR과 ddPCR이 있으며, AAV 시료에 포함된 벡터 게놈의 양을 측정하는 데 사용됩니다.

측정 결과는 시험 방법과 보고 기준에 따라 vg/mL 또는 GC/mL 등의 단위로 표시될 수 있습니다.

게놈 역가는 검출된 벡터 게놈의 양을 의미하며, 감염 능력이나 유전자 발현 능력을 가진 바이러스의 수와 반드시 일치하는 것은 아닙니다.

2. 빈 캡시드 및 풀 캡시드 분석

AAV 캡시드 중에는 완전한 벡터 게놈을 포함하지 않는 빈 캡시드(empty capsid)가 존재할 수 있습니다.

이외에도 일부만 패키징된 게놈이나 불완전한 게놈을 포함하는 입자가 존재할 수 있습니다.

따라서 AAV 제품을 평가할 때는 빈 캡시드 비율만 확인하는 것이 아니라 게놈 완전성, 캡시드 조성 및 기타 품질 특성을 종합적으로 평가해야 합니다.

3. 순도 및 불순물 분석

대표적인 분석 항목은 다음과 같습니다.

• AAV 캡시드 단백질 및 관련 순도 분석
• 숙주세포 단백질(HCP) 잔류량
• 숙주세포 DNA 잔류량
• 엔도톡신 시험
• 제조공정 및 제품 특성에 따른 기타 잔류 불순물 분석

4. 기능적 검증

연구 목적에 따라 다음과 같은 기능 평가를 수행할 수 있습니다.

• 세포 형질도입 효율
• 목적 유전자 발현 수준
• 형광 리포터 유전자 발현
• 표적 세포 또는 조직에서의 생물학적 효과

AAV 품질은 단일 지표만으로 판단할 수 없습니다. 높은 게놈 역가가 반드시 높은 기능적 활성을 의미하지는 않으며, 낮은 빈 캡시드 비율 역시 모든 품질 특성이 우수하다는 것을 보장하지 않습니다.

4단계: 연구용 마우스 체내 검증 및 AAV의 실제 성능 평가

AAV 제품에 대한 필요한 품질시험이 완료되면 연구 계획에 따라 동물실험을 진행할 수 있습니다.

연구용 마우스 모델은 AAV 기초 연구와 초기 비임상 개발에서 널리 활용되는 연구 도구입니다.

이 단계의 핵심은 AAV가 체내에서 의도한 조직으로 전달되고 목적 유전자를 발현하는지 평가하는 것입니다.

1. 적절한 동물 모델 선택

연구 대상 질환, 표적 유전자 및 평가 지표에 따라 야생형 마우스, 유전자 결손 마우스 또는 기타 질환 모델을 선택합니다.

동물 모델마다 생리적 배경이 다르므로 연구 목적과 모델 간의 연관성을 충분히 검토해야 합니다.

2. 투여 경로 평가

대표적인 투여 경로는 다음과 같습니다.

• 정맥 투여
• 뇌내 투여
• 뇌실내 투여
• 안구내 투여
• 근육내 투여
• 국소 조직 투여

투여 경로에 따라 AAV의 조직 분포와 유전자 발현 양상이 달라질 수 있습니다. 구체적인 투여 방법은 연구 목적, 표적 조직 및 실험 설계에 따라 결정해야 합니다.

3. 조직 분포 및 발현 효율 평가

동물실험에서는 다음 항목을 중점적으로 평가합니다.

• 표적 조직에서의 목적 유전자 발현
• 표적 세포의 형질도입 여부
• 조직별 분포 차이
• 목적 유전자의 발현 지속 기간
• 연구 목적과 관련된 약효 지표

4. 초기 안전성 관찰

발현 효율뿐 아니라 동물의 일반적인 상태, 체중 변화, 조직병리학적 소견 및 연구 계획에 따른 안전성 지표도 확인해야 합니다.

마우스에서 확인된 발현 결과가 사람에서의 전달 효율을 직접적으로 예측하는 것은 아닙니다. 종간 캡시드 수용체 차이, 조직 친화성 및 면역반응 등이 서로 다를 수 있기 때문입니다.

따라서 마우스 실험의 성공은 임상 전환을 위한 중요한 단계이지만, 임상 개발에 필요한 모든 요건을 충족했다는 의미는 아닙니다.

5단계: 연구용 AAV에서 임상 전 비임상 개발로의 전환

AAV가 기초 연구와 동물 모델에서 유의미한 결과를 보이면 보다 체계적인 임상 전 개발 단계로 진입할 수 있습니다.

이 단계의 목표는 추가 개발 가능성이 있는 후보 제품을 선정하고, 향후 임상 연구에 적합한 제조공정과 품질관리 체계를 단계적으로 확립하는 것입니다.

1. 후보 벡터 선정

서로 다른 혈청형, 프로모터 및 발현 구조의 성능을 종합적으로 비교하여 후보 AAV 벡터를 선정합니다.

발현 효율뿐 아니라 조직 분포, 작용 기전, 잠재적 면역반응 및 안전성도 고려해야 합니다.

2. 제조공정 개발 및 최적화

연구용 생산공정이 임상 개발에 바로 적용될 수 있는 것은 아닙니다.

프로젝트 진행에 따라 세포 배양, 형질주입, 바이러스 수확, 정제 및 제형화 공정을 체계적으로 최적화하여 재현성과 확장성을 갖춘 제조공정을 구축해야 합니다.

3. 품질 분석법 개발

임상 전 개발 단계에서는 품질관리 체계를 더욱 구체화해야 합니다.

제품 특성과 규제 요구사항에 따라 다음과 같은 분석법을 개발하거나 최적화할 수 있습니다.

• 게놈 역가
• 게놈 완전성
• 캡시드 단백질 및 빈 캡시드/풀 캡시드 분석
• 순도 및 잔류 불순물
• 생물학적 활성
• 안정성 시험

4. 약효 및 안전성 연구

후보 제품과 적응증에 따라 약력학, 생체분포, 약동학 또는 관련 연구와 개발 요건에 부합하는 독성시험을 수행합니다.

이러한 연구 결과는 향후 임상시험 설계와 위험성 평가의 근거가 됩니다.

6단계: GMP 생산 및 임상시험 준비

후보 AAV 제품이 임상 개발 단계에 진입하면 임상시험용 제품의 생산을 준비해야 합니다.

연구용 AAV와 비교하면 GMP 생산은 단순히 제품을 제조하는 것을 넘어, 적용 가능한 규제 요건에 부합하는 체계적이고 추적 가능한 제조 및 품질관리 시스템을 요구합니다.

주요 업무는 다음과 같습니다.

1. 임상 개발에 적합한 제조공정 구축

생산 세포 시스템, 원자재 관리, 제조공정 관리, 바이러스 수확, 정제, 제형화 및 충전 등의 공정을 포함합니다.

2. 품질관리 및 출하 기준 확립

제품 특성과 규제 요구사항에 따라 주요 품질 특성과 관련 시험법을 설정합니다.

3. 안정성 시험

정해진 보관 조건에서 시간에 따른 제품 품질 변화를 평가하여 보관 기간과 임상 사용을 위한 근거를 마련합니다.

4. 배치 간 일관성 관리

제조공정 관리와 품질시험을 통해 서로 다른 생산 배치 간 제품 품질의 일관성을 평가합니다.

GMP 생산을 수행했다고 해서 모든 제조공정의 밸리데이션이 완료되었다는 의미는 아닙니다. 공정 확인 및 검증 요구사항은 제품 개발 단계와 적용 규정에 따라 결정됩니다.

7단계: IND 신청 및 임상시험 진행

필요한 CMC 자료, 비임상 연구 및 임상시험 준비가 완료되면 IND 신청 단계로 진행할 수 있습니다.

미국 FDA 규제 경로에서 IND(Investigational New Drug Application)는 임상시험용 신약 신청을 의미합니다.

IND 제출 자료는 일반적으로 다음과 같은 주요 내용을 포함합니다.

1. CMC 자료

• 제품 구성 및 구조 정보
• 제조공정 및 공정관리
• 품질 기준 및 분석법
• 제조 배치 관련 자료
• 안정성 시험 데이터
• 임상시험용 제품의 품질 정보

2. 비임상 연구 자료

제품 특성과 개발 요건에 따라 약리학, 약력학, 약동학, 생체분포 및 독성학 관련 연구 자료를 제출합니다.

3. 임상시험 계획서

연구 목적, 대상자 선정 기준, 투여 계획, 용량 설계, 안전성 모니터링 및 평가 지표 등을 포함합니다.

IND 신청이 곧 제품의 시판 허가를 의미하는 것은 아닙니다. 신청 이후에도 적용되는 규제기관의 심사 및 임상시험 개시 요건을 충족해야 합니다.

임상 단계에서는 일반적으로 1상, 2상 및 3상 연구가 개발 전략에 따라 진행될 수 있습니다. 다만 제품별 개발 경로는 다를 수 있으며, 모든 프로젝트가 동일한 단계와 순서를 따르는 것은 아닙니다.

충분한 임상 유효성, 안전성 및 제조 품질 관련 근거가 축적되면 BLA(Biologics License Application)와 같은 생물의약품 품목허가 신청 단계로 발전할 수 있습니다.

8단계: AAV 연구부터 임상 개발까지, PackGene은 어떤 서비스를 제공할 수 있을까요?

초기 벡터 설계부터 연구용 AAV 생산, 품질시험, 임상 전 개발 및 GMP 생산에 이르기까지 AAV 프로젝트는 개발 단계마다 서로 다른 기술적 요구사항을 가지고 있습니다.

PackGene은 유전자치료제 연구개발을 위한 벡터 및 바이러스 관련 서비스를 제공하며, 연구기관과 바이오의약품 기업의 다양한 개발 단계에 필요한 기술적 지원을 제공합니다.

1. 벡터 설계 및 플라스미드 제작

• AAV 발현 벡터 설계
• 목적 유전자 클로닝
• 프로모터 및 발현 요소 조합
• AAV 플라스미드 제작 및 서열 검증

2. AAV 바이러스 패키징 및 생산

• Research Grade AAV
• NHP Grade AAV
• HT AAV 생산
• GMP AAV 생산 관련 서비스

프로젝트의 요구사항과 연구 단계에 따라 적합한 AAV 생산 옵션을 선택할 수 있습니다.

3. AAV 품질시험 서비스

게놈 역가, 빈 캡시드/풀 캡시드 분석, 순도 및 기타 관련 품질시험을 지원하여 고객이 AAV 제품의 품질 특성을 평가할 수 있도록 돕습니다.

4. 임상 전 연구 관련 지원

프로젝트 요구사항에 따라 세포 연구, 동물실험 및 비인간 영장류(NHP) 연구에 적합한 AAV 제품을 제공하여 초기 후보 벡터 선정과 연구 검증을 지원합니다.

5. GMP 생산 및 개발 단계 간 연계

추가 개발이 필요한 프로젝트를 대상으로 AAV GMP 생산과 관련 제조공정 및 품질관리 지원을 제공하여 초기 연구에서 후속 임상 개발로 이어지는 과정을 지원합니다.

하나의 연구 프로젝트가 임상 개발 가능성을 갖춘 유전자치료제 후보 제품으로 발전하기까지는 장기간에 걸친 체계적인 연구와 다양한 분야 간 협력이 필요합니다.

PackGene은 벡터 설계, AAV 패키징, 품질시험 및 개발 단계별 생산 서비스를 통해 연구기관과 유전자치료제 개발 기업의 연구개발 과정을 지원하고자 합니다.

결론

AAV 유전자치료제 개발은 단순한 바이러스 패키징으로 끝나는 과정이 아닙니다.

초기 GOI 설계와 혈청형 선정부터 연구용 마우스 체내 검증, 임상 전 연구, GMP 생산 및 IND 신청까지 각 단계에는 과학적 근거, 품질 데이터 및 체계적인 개발 전략이 필요합니다.

AAV 연구를 수행하는 연구자라면 초기 단계부터 전체 개발 과정을 이해하고 계획하는 것이 향후 기술적 연계 과정에서 발생할 수 있는 불확실성을 줄이는 데 도움이 됩니다.

기초 연구 단계에서는 유전자 발현 효과를 평가하고, 임상 전 단계에서는 후보 제품의 약효와 안전성을 검토하며, 임상 개발 단계에서는 완전한 CMC 및 임상 근거를 구축해야 합니다.

이것이 바로 AAV가 실험실에서 임상으로 발전하는 전체적인 과정입니다.

면책사항: 본 글은 AAV 연구 및 유전자치료제 개발에 관한 일반적인 과학 정보 제공을 목적으로 하며, 특정 프로젝트의 임상 개발, 의약품 허가 신청 또는 규제 준수에 관한 공식적인 자문이 아닙니다. 실제 개발 경로, 연구 항목 및 제출 자료 요건은 제품 특성, 적응증 및 목표 시장의 현행 규정에 따라 결정되어야 합니다.