AAV 품질검사에서는 어떤 지표를 확인할까? AAV 품질관리의 핵심 항목 정리

AAV 생산이 끝난 후 검사 결과를 확인할 때 가장 먼저 보는 항목은 보통 바이러스 역가(titer)입니다.

예를 들어 AAV 역가가 1×10¹³ vg/mL로 확인되었다면 수치 자체는 높아 보일 수 있습니다. 하지만 이 값 하나만으로 해당 AAV의 전체적인 품질을 판단하기는 어렵습니다.

AAV 품질은 하나의 지표로 결정되는 것이 아니기 때문입니다.

바이러스 역가뿐만 아니라 바이러스의 동일성(Identity), Empty/Full 비율, 유전체 무결성, 순도, 내독소, 마이코플라스마, 생물학적 활성 등을 함께 확인해야 합니다.

또한 연구 단계와 사용 목적에 따라 중요하게 보는 품질 지표도 달라질 수 있습니다.

그렇다면 AAV 품질검사에서는 구체적으로 어떤 항목을 확인할까요?

AAV 역가: 가장 많이 확인하지만 이것만으로는 부족하다

AAV 품질검사에서 가장 일반적으로 확인하는 항목 중 하나가 바이러스 역가입니다.

현재 AAV의 유전체 역가는 qPCR 또는 ddPCR을 이용해 측정하는 경우가 많으며, 일반적으로 vg/mL(vector genomes per mL) 또는 GC/mL(genome copies per mL)로 표시합니다.

이 수치는 시료에 존재하는 AAV 벡터 유전체의 양을 나타냅니다.

하지만 여기서 주의해야 할 점이 있습니다.

높은 vg 값이 모든 바이러스 입자가 정상적인 생물학적 활성을 가진다는 의미는 아닙니다.

예를 들어 AAV의 유전체 역가는 높더라도 시료에 Empty Capsid가 많이 포함되어 있거나, 부분적으로만 포장된 유전체가 존재할 수 있습니다. 이 경우 실제 세포에서의 형질도입 효율이 역가와 반드시 일치하는 것은 아닙니다.

따라서 역가는 AAV 품질평가에서 중요한 출발점이지만, 이것만으로 전체 품질을 판단하기는 어렵습니다.

Empty Capsid가 얼마나 포함되어 있는지도 중요하다

AAV를 생산하는 과정에서는 모든 캡시드가 완전한 벡터 유전체를 정상적으로 포장하는 것은 아닙니다.

최종 시료에는 Full Capsid, Empty Capsid, Partial Capsid 등이 함께 존재할 수 있습니다.

Full Capsid는 벡터 유전체를 포함하는 바이러스 입자를 의미하고, Empty Capsid는 벡터 유전체가 들어 있지 않은 빈 캡시드를 의미합니다.

따라서 AAV 품질검사에서는 다음과 같은 항목이 중요하게 다뤄집니다.

• Full Capsid
• Empty Capsid
• Full/Empty Ratio
• Partial Capsid

Empty Capsid가 존재한다고 해서 AAV 생산 자체가 실패했다는 의미는 아닙니다. 다만 Empty Capsid의 비율은 최종 제품의 입자 구성과 생산 및 정제 공정의 특성을 평가할 때 중요한 지표가 될 수 있습니다.

AAV 안에 들어 있는 유전체는 완전한가?

AAV의 유전체 역가가 높다고 해서 모든 입자가 완전한 벡터 유전체를 가지고 있다는 의미는 아닙니다.

특히 벡터가 AAV의 제한된 패키징 용량에 가까운 경우에는 유전체 무결성을 더욱 주의해서 확인할 필요가 있습니다.

일부 바이러스 입자에서 벡터 유전체가 부분적으로만 포장되거나 절단된 형태가 존재할 수 있기 때문입니다.

따라서 필요한 경우 다음과 같은 항목을 확인할 수 있습니다.

• Genome Integrity
• Full-length Genome
• Partial Genome
• GOI 무결성
• ITR 등 주요 서열의 무결성

일반적인 소형 벡터에서는 이러한 문제가 상대적으로 덜 중요할 수 있지만, 큰 유전자를 탑재한 AAV, 복잡한 발현 카세트 또는 패키징 용량에 가까운 벡터에서는 유전체 무결성을 더욱 중요하게 살펴볼 필요가 있습니다.

AAV의 순도는 어떻게 확인할까?

높은 바이러스 역가가 곧 높은 순도를 의미하는 것은 아닙니다.

AAV 생산 과정에서는 숙주세포, 플라스미드 및 다양한 생산·정제 공정이 사용되기 때문에 최종 시료에 비목적성 물질이 일부 잔류할 수 있습니다.

대표적으로 다음과 같은 항목을 확인할 수 있습니다.

숙주세포 단백질(HCP)

Host Cell Protein(HCP)은 AAV를 생산하는 숙주세포에서 유래하는 단백질입니다.

따라서 HCP 분석은 정제 과정에서 숙주세포 유래 단백질이 얼마나 제거되었는지 평가하는 데 활용될 수 있습니다.

숙주세포 DNA(Host Cell DNA)

AAV 생산 과정에서 숙주세포 유래 DNA가 잔류할 수 있기 때문에 필요에 따라 Host Cell DNA를 분석합니다.

잔류 플라스미드 DNA

플라스미드 기반 transient transfection 방식으로 AAV를 생산하는 경우, 생산 과정에서 사용된 플라스미드 DNA의 잔류 여부를 확인할 수 있습니다.

이외에도 실제 생산공정과 제품의 용도에 따라 다양한 공정 관련 잔류물에 대한 분석이 추가될 수 있습니다.

동물실험에 사용할 AAV라면 내독소와 마이코플라스마도 확인해야 한다

AAV를 세포실험에만 사용하는 경우에는 일부 안전성 지표의 중요도가 상대적으로 낮을 수 있습니다.

하지만 동물 체내 투여를 계획하고 있다면 시료의 안전성과 관련된 항목을 더욱 꼼꼼하게 확인할 필요가 있습니다.

대표적인 검사 항목은 다음과 같습니다.

• Endotoxin（내독소）
• Mycoplasma（마이코플라스마）
• Sterility（무균시험）
• Bioburden（미생물 오염도）

특히 체내 투여용 AAV에서는 내독소가 중요한 관리 항목 중 하나입니다.

다만 실제로 필요한 검사 항목과 허용 기준은 동물종, 투여 경로, 연구 목적 및 제품의 등급 등에 따라 달라질 수 있습니다.

AAV가 응집되지는 않았을까?

AAV는 생산이 완료된 이후에도 보관 및 취급 과정에서 상태가 변할 수 있습니다.

농축, 정제, 보관 또는 반복적인 동결·해동 과정에서 바이러스 입자가 서로 뭉치는 aggregation이 발생할 수 있습니다.

따라서 일부 AAV 제품에서는 다음과 같은 입자 특성을 추가로 확인하기도 합니다.

• Aggregation
• Particle Size
• PDI
• Particle Distribution

AAV의 응집이 증가하면 시료의 안정성이나 입자 균일성에 영향을 줄 수 있습니다.

따라서 AAV를 장기간 보관하거나 반복적으로 사용하는 경우에는 보관 조건과 동결·해동 횟수도 함께 관리하는 것이 중요합니다.

마지막으로 확인해야 할 것은 AAV의 실제 기능이다

AAV 품질을 평가할 때 역가와 생물학적 활성을 같은 개념으로 생각하면 안 됩니다.

AAV 역가가 높다고 해서 반드시 세포에서 높은 형질도입 효율이나 원하는 생물학적 기능을 나타내는 것은 아닙니다.

따라서 벡터의 목적에 따라 실제 기능을 확인하는 시험이 필요할 수 있습니다.

예를 들어 다음과 같은 방법을 사용할 수 있습니다.

• 세포 형질도입 시험
• GFP, mCherry 등 리포터 유전자 발현 분석
• Luciferase 발현 분석
• GOI 발현 분석
• 기능성 단백질 분석
• Potency Assay

어떤 방법을 적용할지는 AAV 벡터의 설계와 최종 사용 목적에 따라 결정해야 합니다.

AAV 품질검사에서는 무엇을 확인해야 할까?

결국 AAV 품질검사는 몇 가지 간단한 질문으로 정리할 수 있습니다.

내가 원하는 바이러스가 맞는가?

→ Identity

바이러스 유전체가 얼마나 존재하는가?

→ vg/mL, GC/mL 등의 Titer

바이러스 입자에 유전체가 제대로 들어 있는가?

→ Full/Empty 및 관련 입자 분석

포장된 유전체가 완전한가?

→ Genome Integrity

시료가 얼마나 순수한가?

→ HCP, Host Cell DNA, 잔류 플라스미드 DNA 등

동물실험이나 체내 투여에 적합한가?

→ Endotoxin, Mycoplasma, Sterility 등

실제로 원하는 기능을 나타내는가?

→ Transduction 및 기능성 분석

결국 AAV 품질은 단순히 “바이러스 역가가 높은가?”만으로 판단하기 어렵습니다.

Titer, Full/Empty, Genome Integrity, Purity, Safety, Biological Activity 등 여러 지표를 함께 살펴봐야 AAV의 전반적인 품질을 보다 정확하게 평가할 수 있습니다.

또한 모든 AAV에 동일한 검사 항목을 적용할 필요는 없습니다. 연구용 AAV인지, 동물실험용 AAV인지, 임상 전 단계 또는 GMP 생산용 AAV인지에 따라 필요한 품질검사 항목과 관리 수준이 달라질 수 있습니다.

AAV 품질검사를 계획할 때는 벡터의 종류, 연구 목적, 투여 방법 및 개발 단계를 함께 고려해 필요한 분석 항목을 결정하는 것이 중요합니다.