AAV 패키징이 실패하는 이유는? AAV 바이러스가 검출되지 않는 원인

재조합 AAV(rAAV)를 패키징하는 과정에서 모든 생산 과정을 완료했음에도 불구하고 최종 샘플에서 AAV가 검출되지 않거나, AAV 역가가 검출한계 수준까지 낮아지는 경우가 있습니다.

이러한 상황이 발생하면 흔히 AAV 패키징 자체가 실패했다고 생각하기 쉽습니다. 하지만 AAV 생산에는 벡터 설계, 플라스미드 품질, 생산 세포 상태, 트랜스펙션, 패키징 시스템, 정제 및 검출 등 여러 단계가 관여하기 때문에 특정 단계에서 문제가 발생하더라도 최종적으로 AAV가 검출되지 않을 수 있습니다.

따라서 AAV 패키징 후 바이러스가 검출되지 않는 경우에는 최종 역가만 확인하기보다는 전체 생산 과정을 단계별로 살펴보면서 원인을 구분하는 것이 중요합니다.

1.AAV 벡터 설계를 먼저 확인해야 합니다

AAV 패키징 후 바이러스가 전혀 검출되지 않는 경우 가장 먼저 확인해야 할 부분 중 하나는 AAV 벡터 자체의 설계입니다.

AAV 벡터 양쪽에 위치하는 ITR(Inverted Terminal Repeat)은 AAV 벡터 게놈의 중요한 구성 요소로, 벡터 게놈의 복제와 패키징 과정에 관여합니다. ITR에 결실이나 재배열 등의 구조적 이상이 발생하면 플라스미드의 농도와 일반적인 순도 지표가 정상적으로 보이더라도 AAV 생산에 영향을 줄 수 있습니다.

따라서 AAV 벡터 플라스미드를 확인할 때는 DNA 농도뿐만 아니라 ITR의 무결성도 함께 확인하는 것이 중요합니다.

또한 벡터 게놈의 크기도 중요한 요소입니다. 기존의 재조합 AAV(rAAV)는 패키징 가능한 게놈 크기에 제한이 있기 때문에, ITR 사이의 서열이 지나치게 커지면 패키징 효율이 낮아지거나 벡터 게놈의 완전성에 영향을 줄 수 있습니다.

특히 큰 프로모터, GOI, 조절 서열, polyA 등을 함께 사용하는 경우에는 GOI의 크기만 확인하는 것이 아니라 ITR 사이에 포함되는 전체 벡터 게놈의 크기를 고려해야 합니다.

다른 AAV 벡터는 정상적으로 생산되는데 특정 GOI를 포함한 벡터만 반복적으로 생산되지 않는다면, 해당 벡터의 구조와 ITR, GOI 서열 등을 우선적으로 확인할 필요가 있습니다.

2.플라스미드 품질도 AAV 패키징에 영향을 줄 수 있습니다

플라스미드를 이용한 AAV 일시적 트랜스펙션 생산에서는 여러 플라스미드가 함께 사용됩니다. 따라서 그중 하나라도 품질이나 구조에 문제가 있으면 다른 생산 조건이 정상적이더라도 AAV 생산량이 감소할 수 있습니다.

대표적으로 확인해야 할 사항은 플라스미드의 동일성, DNA 분해 여부, 플라스미드 구조, ITR 재배열, 순도 등의 문제입니다.

특히 ITR을 포함하는 AAV transfer plasmid는 구조적 안정성을 확인하는 것이 중요합니다. 일반적인 플라스미드 농도와 순도 결과가 정상이라고 해서 해당 플라스미드가 반드시 AAV 생산에 적합한 상태라고 단정할 수는 없습니다.

동일한 벡터를 사용해 여러 번 패키징했는데도 AAV가 검출되지 않는 반면 다른 벡터에서는 정상적인 생산이 이루어진다면, 동일한 조건에서 생산을 반복하기 전에 플라스미드의 identity와 구조를 다시 확인하는 것이 도움이 될 수 있습니다.

3.생산 세포의 상태도 확인해야 합니다

AAV 생산에서는 사용하는 생산 세포의 상태가 최종 생산량에 영향을 줄 수 있습니다. HEK293 계열 세포를 사용하는 경우 세포의 증식 상태, 생존율, 세포 밀도, 배양 조건 등이 트랜스펙션과 AAV 생산에 영향을 미칠 수 있습니다.

예를 들어 세포 상태가 평소와 다르거나 세포 밀도가 적절하지 않으면 트랜스펙션 효율이 떨어지고, 결과적으로 AAV 생산에도 영향을 줄 수 있습니다.

또한 동일한 시기에 여러 종류의 AAV 벡터에서 역가가 동시에 감소했다면 특정 벡터만을 원인으로 보기보다는 생산 세포와 배양 조건을 함께 확인할 필요가 있습니다.

4.트랜스펙션이 제대로 이루어졌는지 확인합니다

플라스미드를 이용한 AAV 생산에서는 트랜스펙션 역시 중요한 단계입니다.

AAV 생산에 필요한 각 플라스미드가 생산 세포에 적절하게 도입되지 않으면 이후 필요한 유전자 발현, 벡터 게놈 복제 및 캡시드 형성 등에 영향을 줄 수 있습니다.

트랜스펙션 결과에는 세포 상태, DNA 품질, 트랜스펙션 시약, DNA와 시약의 조합 및 실험 조건 등 여러 요인이 영향을 미칠 수 있습니다.

AAV가 전혀 검출되지 않는 경우에는 적절한 트랜스펙션 대조군 등을 활용하여 문제가 벡터 자체에 있는지, 아니면 트랜스펙션 과정에 있는지를 구분하는 것이 중요합니다.

5.AAV 패키징 시스템의 구성도 확인해야 합니다

재조합 AAV 생산에는 벡터 게놈뿐만 아니라 AAV 복제와 캡시드 형성, 필요한 helper 기능을 제공하는 여러 구성 요소가 필요합니다.

사용하는 생산 플랫폼에 따라 3-plasmid system이나 2-plasmid system 등 구성 방식은 달라질 수 있지만, 각 시스템에 필요한 기능이 적절하게 제공되어야 한다는 점은 동일합니다.

Rep/Cap, helper 기능 또는 AAV 벡터 플라스미드 등에 문제가 있으면 AAV가 정상적으로 생산되지 않을 수 있습니다.

따라서 AAV 패키징에 문제가 발생했을 때는 사용한 플라스미드의 종류, 혈청형 및 각 구성 요소의 조합이 적절한지 확인하는 것이 필요합니다.

6.AAV 혈청형에 따라 생산성이 달라질 수 있습니다

AAV 혈청형은 조직 선택성과 체내 분포뿐만 아니라 생산 특성에도 영향을 줄 수 있습니다.

동일한 벡터 구조와 유사한 생산 조건을 사용하더라도 캡시드의 차이에 따라 AAV 생산량이나 회수 특성이 달라질 수 있습니다.

예를 들어 특정 혈청형에서는 정상적인 AAV 역가가 확인되지만 다른 혈청형에서는 역가가 크게 낮아지는 경우가 있습니다.

이러한 경우 단순히 생산 과정의 오류로 판단하기보다는 사용한 혈청형과 생산 시스템의 조합에 따른 차이도 함께 고려해야 합니다.

7.정제 및 회수 과정에서 AAV가 손실되지 않았는지 확인합니다

AAV가 생산되었음에도 최종 제품에서 바이러스가 검출되지 않는 경우에는 정제와 회수 과정도 확인해야 합니다.

예를 들어 회수 효율이 낮거나 정제 과정에서 AAV가 손실되거나 농축 과정에서 회수율이 낮아지면 최종 샘플의 AAV 역가가 크게 감소할 수 있습니다.

가능하다면 최종 제품만 확인하지 말고 생산 과정의 여러 단계에서 AAV를 확인하는 것이 좋습니다.

예를 들어,

회수 샘플 → 정제 전 샘플 → 정제 중간체 → 최종 AAV 제품

과 같이 단계별 결과를 비교하면 어느 단계에서 AAV가 감소했는지 파악하는 데 도움이 됩니다.

회수 단계에서는 AAV가 검출되지만 정제 후 검출되지 않는다면 벡터 설계나 트랜스펙션뿐만 아니라 정제 및 회수 과정에 문제가 없는지도 확인해야 합니다.

8.AAV가 검출되지 않았다고 해서 반드시 AAV가 없는 것은 아닙니다

AAV 패키징 문제를 확인할 때는 검출 방법 자체도 함께 확인해야 합니다.

예를 들어 qPCR이나 ddPCR을 이용해 AAV 게놈을 측정하는 경우 primer와 probe 설계, 검출 대상 영역, DNA 추출 효율, 샘플 희석 및 PCR 반응 조건 등이 결과에 영향을 줄 수 있습니다.

따라서 검출 결과가 음성으로 나타났다고 해서 바로 AAV가 전혀 생산되지 않았다고 판단하는 것은 적절하지 않습니다. 양성 대조군과 표준물질 등을 통해 검출 시스템이 정상적으로 작동했는지 확인하는 것이 중요합니다.

특히 벡터 구조를 변경한 후 갑자기 AAV가 검출되지 않는 경우에는 새롭게 변경된 벡터 구조와 검출 대상 영역이 적절하게 대응하는지도 확인할 필요가 있습니다.

필요에 따라 AAV 게놈 역가뿐만 아니라 캡시드 관련 분석이나 기능성 평가 등 목적에 적합한 여러 분석 방법을 함께 사용하면 상황을 보다 정확하게 판단할 수 있습니다.

9.AAV 패키징 후 바이러스가 검출되지 않을 때 어떻게 확인해야 할까요?

AAV 패키징 후 바이러스가 검출되지 않는 경우에는 먼저 문제가 어느 단계에서 시작되었는지를 확인하는 것이 중요합니다.

특정 벡터만 생산되지 않는다면 ITR 무결성, 벡터 게놈 크기, GOI 서열 및 플라스미드 구조 등을 우선적으로 확인할 수 있습니다.

반대로 여러 종류의 AAV 벡터에서 동시에 역가가 감소하거나 바이러스가 검출되지 않는다면 생산 세포, 트랜스펙션, 패키징 시스템 및 공통 생산 조건을 확인하는 것이 필요합니다.

또한 회수 단계에서는 AAV가 검출되지만 최종 제품에서 검출되지 않는다면 정제, 농축 및 회수 과정에 문제가 없는지 확인해야 합니다.

특정 검출 방법에서만 AAV가 검출되지 않는 경우에는 검출 시스템 자체를 다시 확인할 필요가 있습니다.

결국 AAV 패키징 실패를 해결하기 위해 중요한 것은 동일한 생산 과정을 반복하는 것보다 AAV가 어느 단계에서 감소하거나 검출되지 않기 시작했는지를 먼저 파악하는 것입니다.

정리

AAV 패키징 후 바이러스가 검출되지 않는 원인은 한 가지로 한정되지 않습니다. ITR을 포함한 벡터 설계, 플라스미드 품질, 생산 세포 상태, 트랜스펙션 효율, 패키징 시스템, AAV 혈청형, 정제 및 회수 과정, 그리고 검출 방법까지 다양한 요인이 최종 결과에 영향을 줄 수 있습니다.

따라서 AAV 패키징이 실패했다고 바로 판단하기보다는 전체 생산 과정을 단계별로 확인하여 문제가 처음 발생한 지점을 찾는 것이 중요합니다.

AAV 생산 과정에서 문제가 반복되는 경우에는 벡터 설계와 플라스미드 QC부터 세포 상태, 생산 과정, 정제 및 최종 검출까지 하나의 흐름으로 확인하는 것이 원인을 보다 효율적으로 파악하는 데 도움이 됩니다.