재조합 AAV 생성에는 어떤 플라스미드가 필요한가?

재조합 AAV(rAAV)를 생성할 때 가장 일반적으로 사용되는 방식은 3-플라스미드 시스템(three-plasmid system)입니다. AAV 생산 플랫폼에 따라 2-플라스미드 시스템, 4-플라스미드 시스템 등 다양한 구성이 사용되기도 합니다. 그러나 기본적인 기능은 유사하며, 주로 다음과 같은 플라스미드가 사용됩니다.

1. 전달 플라스미드(Transfer Plasmid)

전달 플라스미드는 목적 유전자(Gene of Interest, GOI)를 탑재하는 플라스미드로, 최종적으로 AAV 입자에 패키징되는 유전 물질을 제공합니다.

일반적인 구조는 다음과 같습니다.

ITR — 프로모터 — 목적 유전자(GOI) — PolyA — ITR

주요 구성 요소는 다음과 같습니다.

• ITR(Inverted Terminal Repeat, 역말단 반복서열): AAV 유전체의 복제와 패키징에 필요한 서열이며, 재조합 AAV 유전체의 중요한 경계를 형성합니다.
• Promoter(프로모터): 목적 유전자의 발현을 조절합니다. 대표적인 예로 CMV, CAG, EF1α, hSyn 등이 있습니다.
• GOI(Gene of Interest): 연구 또는 유전자 전달의 대상이 되는 목적 유전자입니다.
• PolyA(polyadenylation signal, 폴리아데닐화 신호): 전사 종결과 mRNA 안정화에 관여합니다.

중요한 점은 최종적으로 AAV 입자에 주로 패키징되는 것은 두 개의 ITR 사이에 위치한 서열이라는 것입니다.

2. Rep/Cap 플라스미드(Rep/Cap Plasmid)

Rep/Cap 플라스미드는 AAV의 복제와 캡시드 형성에 필요한 단백질을 제공합니다.

주요 구성 요소는 다음과 같습니다.

• Rep 유전자: Rep 단백질을 암호화하며, AAV 유전체의 복제와 패키징 등의 과정에 관여합니다.
• Cap 유전자: AAV 캡시드 단백질 VP1, VP2, VP3를 암호화합니다.

AAV 혈청형에 따라 달라지는 주요 요소 중 하나가 Cap 유전자입니다.

예를 들면 다음과 같습니다.

• AAV2 Cap → AAV2 캡시드
• AAV8 Cap → AAV8 캡시드
• AAV9 Cap → AAV9 캡시드

따라서 AAV9를 생산하려는 경우 일반적으로 AAV9 Cap을 제공할 수 있는 캡시드 플라스미드를 사용합니다.

3. Helper 플라스미드(보조 플라스미드)

Helper 플라스미드는 AAV 생산 과정에 필요한 헬퍼 바이러스 유래 기능을 제공합니다. 일반적으로 아데노바이러스 유래 유전자가 사용됩니다.

대표적인 보조 기능에는 다음이 포함됩니다.

• E2A
• E4
• VA RNA

이러한 요소들은 세포 내에서 AAV의 복제와 캡시드 형성에 적합한 환경을 조성하는 데 필요한 기능을 제공합니다.

3-플라스미드 시스템을 간단하게 이해하면

전체적인 과정을 간단하게 표현하면 다음과 같습니다.

Transfer 플라스미드가 ‘탑재할 유전자’를 제공 → Rep/Cap 플라스미드가 ‘복제 기능과 캡시드’를 제공 → Helper 플라스미드가 ‘생산에 필요한 보조 기능’을 제공 → 세포 내에서 재조합 AAV 입자가 형성됩니다.

4. 왜 ‘4-플라스미드 시스템’도 있는가?

일부 AAV 생산 플랫폼에서는 기능을 더욱 세분화하여 Rep와 Cap을 서로 다른 플라스미드에서 제공하기도 합니다.

이 경우 다음과 같은 4개의 플라스미드로 구성됩니다.

1. Transfer plasmid
2. Rep plasmid
3. Cap plasmid
4. Helper plasmid

따라서 ‘3-플라스미드 시스템’과 ‘4-플라스미드 시스템’은 서로 모순되는 개념이 아닙니다. 기본적인 기능은 동일하며, Rep와 Cap 기능을 플라스미드에 어떻게 분배하느냐에 따른 설계상의 차이입니다.

정리

재조합 AAV 생성에서는 Transfer, Rep/Cap, Helper라는 세 가지 주요 기능이 중요합니다. 특히 Transfer 플라스미드에는 AAV 벡터로 패키징하고자 하는 목적 유전자가 포함되며, 해당 영역은 ITR에 의해 양쪽에서 둘러싸여 있습니다.

AAV 벡터의 구조와 설계를 이해하기 위해서는 ITR, Rep, Cap, Promoter, PolyA 등 주요 구성 요소가 각각 어떤 역할을 하는지 이해하는 것이 중요합니다.