AAV 초원심분리 후 분획층별 성분 분석

AAV(아데노연관바이러스)를 초원심분리(ultracentrifugation) 한 뒤 “각 층에 무엇이 존재하는가”는 사용한 분리 방식에 따라 달라집니다. 가장 흔한 방법은 아이오딕사놀 밀도구배 초원심분리(iodixanol gradient ultracentrifugation) 와 CsCl(염화세슘) 밀도구배 원심분리 입니다. 현재 AAV 정제에서는 아이오딕사놀 방식이 가장 널리 사용되므로 이를 기준으로 설명드리겠습니다.

1. 아이오딕사놀 밀도구배 초원심분리 (가장 일반적)

보통 아래와 같이 층을 형성합니다. (위 → 아래)

15% 층 (최상층)

• 시료 상층액 또는 조추출물
• 세포 파편, 단백질 불순물, 가벼운 잔여물 다수 포함

25% 층

• 일부 불순물 단백질
• Empty capsid 일부
• 상대적으로 밀도가 낮은 AAV 입자

40% 층 (가장 중요)

• 유전체를 포함한 완전 입자(full capsid)가 주로 존재
• 일반적으로 40% 하단부 또는 40%-60% 계면 에 집중됨

60% 층 (최하층)

• 고밀도 불순물
• 응집체(aggregate)
• 무거운 입자성 잔여물

2. 실제 회수 위치 (일반적 실험 방식)

AAV 회수 시 일반적으로:

주사바늘로 튜브 측면을 천자하여 40%-60% 계면 부근에서 약 2–4 mL 회수 합니다.

이 구간이 보통 역가(titer)가 높고 순도도 우수 합니다.

3. Empty capsid / Full capsid 분포

• Empty capsid: 밀도가 낮아 25%-40% 부근
• Full capsid: 밀도가 높아 40%-60% 계면 부근
• 응집체/파편: 최상층 또는 최하층

4. CsCl 밀도구배 원심분리의 경우

CsCl 방식은 empty/full capsid 분리가 더 선명합니다.

• 상단 밴드: Empty capsid
• 하단 밴드: Full capsid (DNA 포함 입자)

다만 독성, 처리 시간, 투석 필요성 때문에 최근에는 아이오딕사놀 방식이 더 많이 사용됩니다.