서로 다른 정제 방법은 AAV의 활성에 영향을 미치는가.

AAV의 정제 방법은 바이러스의 특성에 영향을 미치며, 많은 경우 그 영향은 상당히 크다. 특히 이러한 영향은 단순한 “물리적 역가(physical titer)”를 넘어 “감염 효율(기능적 역가, functional titer)”에 직접적으로 반영된다.

서로 다른 정제 방법은 AAV의 순도, 구조적 완전성 및 입자 조성을 변화시키며, 그 결과 실제 감염 활성에 영향을 미친다.

영향이 발생하는 주요 기전：

1）empty 캡시드와 full 캡시드의 비율（full/empty capsid）

• 일부 정제 방법(예: PEG 침전)은 두 입자의 구분이 어렵다.
• 반면 CsCl 또는 아이오딕사놀(iodixanol) 밀도 구배는 보다 효과적인 분리가 가능하다.
• empty 캡시드 비율이 높을 경우, 측정된 역가는 높게 나타날 수 있으나 실제 감염 능력은 낮다.

2）불순물 잔존

• 숙주 유래 단백질, DNA, 염, PEG 등이 포함될 수 있다.
• 이들은 세포 상태에 영향을 미치고 바이러스의 세포 진입 및 발현 과정을 방해할 수 있다.
• 일반적으로 순도가 높을수록 기능적 역가의 신뢰성이 높다.

3）바이러스 구조 손상

• CsCl을 이용한 장시간 초원심분리는 캡시드 안정성에 영향을 줄 수 있다.
• 또한 반복적인 동결-해동 역시 활성을 저하시킨다.
• 보다 온화한 처리 조건일수록 바이러스 활성이 잘 보존된다.

4）완충 용액 및 최종 제제 조건

• pH, 염 농도, 계면활성제(예: Pluronic F68)의 포함 여부 등이 영향을 미친다.
• 이러한 요소는 바이러스 안정성과 비특이적 흡착 손실에 영향을 준다.

대표적인 정제 방법의 특징：

1.PEG 침전

• 공정이 간단하고 수율이 높음
• 순도가 낮고 empty 캡시드 비율이 높아 활성의 변동성이 큼

2.아이오딕사놀 밀도 구배（iodixanol gradient）

• 활성이 잘 보존되며 비교적 온화한 공정
• 동물실험에서 널리 사용됨
• empty 캡시드 제거 효율은 CsCl보다 낮음

3.CsCl 밀도 구배

• full/empty 분리 효율이 가장 우수함
• 처리 시간이 길고 바이러스에 부담을 줄 수 있음

4.크로마토그래피 방법（AVB, 이온교환 등）

• 대량 생산이 가능하며 재현성이 높음
• 활성과 순도의 균형이 우수함
• 장비 및 공정 최적화가 필요함

흔한 오해：

많은 경우 vg(게놈 역가)만을 지표로 사용하지만, 실제로는：

핵심적으로 중요한 것은 기능적 역가(transducing units)이다.

동일한 10¹² vg/mL라 하더라도, 정제 방법에 따라 감염 효율은 수 배에서 최대 한 자릿수(orders of magnitude)까지 차이가 날 수 있다.

요약： 정제 방법은 단순히 “바이러스의 양”을 결정하는 것이 아니라, “실제로 감염 및 발현이 가능한 유효 바이러스 입자의 비율”을 결정한다.