AAV 매개 유전자 노크다운 실험에서 세포 예비실험이 필요한가요?

결론: 원칙적으로 사전 세포 검증을 강력히 권장합니다.

AAV를 이용한 유전자 노크다운 연구에서는 동물실험에 앞서 in vitro(세포 수준) 예비 검증을 수행함으로써 실험 성공률을 크게 향상시킬 수 있습니다.

■ 세포 예비실험이 필요한 이유

1. 노크다운 효율 사전 평가

AAV 기반 노크다운은 주로 다음과 같은 방식으로 수행됩니다:

• shRNA

• miRNA 기반 shRNA

• CRISPRi (dCas9 시스템)

간섭 서열에 따라 노크다운 효율 차이가 크게 나타날 수 있으므로, 세포 수준에서 다음과 같은 분석이 필요합니다:

• qPCR을 통한 mRNA 발현 분석

• Western blot을 통한 단백질 발현 분석

이를 통해 가장 효율적인 간섭 서열을 선별할 수 있습니다.

2. 발현 카세트 기능 확인

사전에 다음 사항을 확인해야 합니다:

• U6, H1 등의 프로모터가 정상적으로 작동하는지 여부

• 비의도적 스플라이싱 또는 발현 이상 여부

• 세포 감염 효율이 충분한지 여부

3. 동물실험 리스크 최소화

직접 동물실험을 진행할 경우 다음과 같은 위험이 존재합니다:

• 노크다운 효율 부족

• 조직 특이적 발현 실패

• 명확한 표현형이 나타나지 않음

동물실험은 비용과 시간이 많이 소요되므로 사전 검증이 매우 중요합니다.

■ 반드시 세포 예비실험이 필요한 경우

• 신규 설계 shRNA 서열

• 미검증 표적 유전자

• 신규 AAV 혈청형 사용

• 새로운 프로모터 조합

• 해당 벡터 시스템을 처음 사용하는 경우

■ 예외적으로 생략 가능하나 제한적임

• 이미 논문에서 충분히 검증된 shRNA 서열

• 동일 연구실에서 검증된 구축 시스템

단, 이 경우에도 최소한의 발현 검증은 권장됩니다.

■ 권장 실험 프로세스

1. 1.2~3개의 shRNA 서열 설계

2. 2.플라스미드 트랜스펙션을 통한 노크다운 효율 평가

3. 3.최적 서열 선정 후 AAV 패키징

4. 4.바이러스 감염 후 재검증

5. 5.동물실험 진행

■ 요약

AAV 기반 유전자 노크다운 연구에서는 동물실험 이전에 in vitro 세포 예비실험을 수행함으로써 실험 성공률을 높이고 연구 비용 및 시간을 효율적으로 관리할 수 있습니다.