AAV 부분 포장, 오류 포장 및 불완전 포장

1. 부분 포장 (Partial Packaging)

정의

부분 포장이란 AAV 캡시드 내부에 목표 유전자 발현 카세트의 일부만 포장되고, 완전한 길이의 트랜스진이 포함되지 않은 상태를 의미한다.
주로 AAV 포장 용량 한계(약 4.7 kb)에 근접하거나 초과할 경우 발생한다.

주요 원인

• 트랜스진 크기 과도 (>4.7 kb)

• ITR 및 내부 서열에 의한 2차 구조 형성

• Rep 단백질에 의한 복제 조기 종료

• 복잡한 발현 카세트 구조(반복 서열, 다중 polyA 등)

특징

• 캡시드 구조는 정상

• 게놈의 5′ 또는 3′ 말단 결손이 흔함

• 단일 부위 qPCR 사용 시 기능적 타이틀 과대평가 가능

실험에 미치는 영향

• 유전자 발현 실패 또는 매우 낮은 발현

• in vivo 실험 재현성 저하

• “타이틀은 높은데 발현이 없는” 결과 초래

2. 오류 포장 (Mispackaging)

정의

오류 포장은 AAV 캡시드에 목표 AAV 벡터가 아닌 DNA 조각이 포장되는 현상을 의미한다.

오류 포장되는 DNA 예

• 생산 세포(예: HEK293)의 유전체 DNA

• Helper 플라스미드 서열

• Rep/Cap 플라스미드 조각

• 비목적 AAV 서열

주요 원인

• 유리 DNA 분해 불충분

• 플라스미드 비율 불균형

• 세포 파쇄 후 핵산 제거 미흡

• Rep 발현 이상

실험에 미치는 영향

• 기능성 AAV 비율 감소

• in vivo 및 전임상 연구에서 안전성 리스크

• qPCR 기반 타이틀의 허위 상승

3. 불완전 포장 (Incomplete Packaging)

정의

불완전 포장은 AAV 내부에 포장된 게놈 DNA가 구조적으로 완전하지 않은 상태를 의미하며, 다음을 포함한다:

• 한쪽 ITR 결손

• ITR 구조 이상

• 비대칭 또는 비정상 snapback 게놈

※ 부분 포장이 “길이” 문제라면, 불완전 포장은 구조적 완전성 결여에 초점을 둔다.

주요 원인

• ITR 서열 변이 또는 불안정성

• DNA 복제 중 손상

• 세포 스트레스 및 배양 조건 불안정

• Rep 매개 복제 이상

실험에 미치는 영향

• 안정적인 이중가닥 DNA 형성 실패

• 전사 개시 불가

• 유전자 발현 효율 현저한 저하

4. 세 가지 유형 비교

5. 주요 분석 및 평가 방법

• 다중 부위 qPCR (5′ / 중간 / 3′)

• ddPCR 기반 게놈 완전성 분석

• Southern blot

• NGS 기반 오류 포장 DNA 분석

• 기능성 평가(감염 실험, 발현 분석)