고효율 AAV 생산을 위한 3-plasmid 시스템 핵심 포인트

1️⃣ 3-Plasmid 시스템 기본 구성 이해

AAV 생산은 세 가지 플라스미드의 균형이 핵심입니다.

👉 어느 하나라도 과다·부족하면 전체 패키징 효율이 급격히 감소합니다.

2️⃣ 플라스미드 품질 (Quality is King)

고효율 생산의 전제 조건입니다.

• Endotoxin-free plasmid (≤5 EU/mg 권장)

• Supercoiled 비율 ≥80%

• 반복 동결·해동 금지

• 대장균에서 ITR 안정성 확인 필수

❗ ITR 부분 재조합은 저역가·불완전 캡시드의 주요 원인입니다.

3️⃣ 플라스미드 비율 최적화

가장 널리 쓰이는 기본 비율:

Transfer : Rep/Cap : Helper = 1 : 1 : 1 (w/w)

하지만 실제로는 다음과 같이 조정하면 효율이 올라가는 경우가 많습니다.

Cap 발현이 약한 혈청형 → Rep/Cap 비율 소폭 증가

큰 삽입 유전자(>4.5 kb) → Transfer 비율 증가

👉 혈청형·유전자 크기별 미세 조정이 고역가의 핵심입니다.

4️⃣ 세포 상태 관리 (HEK293 계열)

AAV 생산은 세포 컨디션에 매우 민감합니다.

• HEK293 / 293T / 293A 사용

• Transfection 시 70–80% confluency

• Passage number ≤30 권장

• Mycoplasma-free 필수

📉 세포 스트레스가 있으면 full capsid 비율 급감합니다.

5️⃣ Transfection 조건 최적화

일반적인 권장 조건:

• Serum-free 조건에서 complex 형성 (15–20 min)

• Transfection 후 6–8 h 뒤 serum 포함 배지 교체 가능

💡 PEI 과다 사용은 세포 독성 + empty capsid 증가 원인이 됩니다.

6️⃣ 수확 타이밍 (Harvest Timing)

• 최적 수확 시점: 48–72 h post-transfection

• 너무 빠르면 → 낮은 바이러스 수율

• 너무 늦으면 → 바이러스 분해·단백질 오염 증가

👉 혈청형별로 48 h vs 72 h 비교 테스트 권장

7️⃣ Empty vs Full Capsid 관리

고효율 AAV의 핵심은 Full capsid 비율입니다.

영향 요인:

• Transfer plasmid 양

• Rep 발현 수준

• 세포 대사 상태

• 수확 타이밍

➡ CsCl / Iodixanol gradient 조건 최적화 병행 필요

8️⃣ 소규모 파일럿 테스트 필수

바로 대량 생산하지 말고:

1. 6-well / 10-cm dish 소량 패키징

2. qPCR / ddPCR로 genome titer 확인

3. Western / ELISA로 capsid 확인

📌 파일럿에서 성공한 조건만 Scale-up 해야 재현성이 확보됩니다.