렌티바이러스(Lentivirus) 패키징 주의사항

1. 플라스미드 관련

1. 플라스미드 순도 요구

   • OD260/280: 1.8–2.0

   • 반드시 Endotoxin-free 플라스미드를 사용해야 전사 효율 및 바이러스 역가가 안정적임.

2. 플라스미드 비율

   • 3-플라스미드 시스템(Transfer : Packaging : Envelope)
     → 일반적으로 4 : 3 : 1 (질량비)

   • 4-플라스미드 시스템은 Gag/Pol, Rev, VSVG 비율을 정확히 유지해야 함.

3. 삽입 유전자 크기 제한

   • 4.5 kb 이상이면 역가가 크게 감소.

   • 8 kb 초과 시 패키징 효율이 매우 낮아짐.

2. 세포 관련(HEK293T)

1. 세포 상태 중요

   • 건강하고 오염(특히 마이코플라스마)이 없어야 함.

   • 접착 밀도 **70–90%**에서 트랜스펙션 효율이 가장 좋음.

2. 세포 계대수

   • HEK293T는 P5–P20 사이가 가장 적절.

3. 배양 조건

   • 37℃, 5% CO₂

   • 배지: 고포도당 DMEM + 10% FBS(비가열 처리 권장)

3. 트랜스펙션 단계 주의사항

1. 적절한 트랜스펙션 시약 선택

   • PEI 또는 Lipofectamine 3000 사용 가능.

   • PEI는 pH 7.0–7.1일 때 효율이 높음.

2. 엄격한 무균 조작

   • 모든 조작을 생물안전작업대(BSC) 안에서 수행.

3. 배지 교체 타이밍

   • PEI: 트랜스펙션 후 6–8시간 뒤 배지 교체 권장

   • Lipo 계열: 일반적으로 배지 교체 불필요

4. 트랜스펙션 복합체 신선도

   • DNA/시약 혼합 후 20분 이내에 사용해야 효율 유지.

4. 바이러스 상청 수집

1. 수집 시점

   • 일반적으로 48h, 72h에 두 번 수집.

   • 역가는 보통 48–60h에서 가장 높음.

2. 상청 필터링

   • 0.45 μm 필터(PVDF 또는 PES) 사용.

3. 동결-해동 금지

   • 렌티바이러스는 1번 동결-해동만으로도 50% 이상 역가 손실.

5. 농축 및 보관

1. 농축 방법

   • 초원심분리(ultracentrifugation)

   • PEG/PEG8000

   • 상용 Lenti concentrator

2. 보관 조건

   • −80℃ 보관, 소량 분주 보관(50–100 μL)

   • 온도 변화에 민감하므로 작업 속도가 중요.

6. 생물안전 주의사항 (BSL-2)

1. BSL-2 수준에서 실험

   • BSC, 장갑, 실험복 등 PPE 필수.

2. 오염 폐기물 처리

   • 염소계 소독제에 30분 이상 침지 후 폐기.

3. 에어로졸 및 바늘 자상 주의

   • 바이러스 노출의 주요 원인이므로 조심해야 함.

4. 피부/눈 접촉 시

   • 즉시 다량의 물로 씻고 필요 시 의학적 평가.

7. 바이러스 역가를 높이는 팁

• 트랜스펙션 용액은 Opti-MEM 사용 추천

• 활력이 높은 HEK293T 사용

• 트랜스펙션 24시간 전 신선한 배지로 교체

• pH가 산성으로 치우치지 않도록 관리