AAV 바이러스 패키징 주의사항

1. 세포 준비

1. 권장 세포주: HEK293T 또는 AAV-293

   • 세포 상태가 건강하고 오염이 없어야 하며 과도한 융합이 없어야 합니다.

2. 적정 세포 밀도: 70–85%

   • 너무 낮으면 전사 효율 감소, 너무 높으면 바이러스 생산량 감소.

3. 항생제 사용 금지

   • 전사 효율과 세포 상태에 영향을 줍니다.

4. 전사 전 신선한 배지로 교환 권장 (2–4시간 전)

2. 플라스미드 관련 주의사항

1. 3-플라스미드 시스템 구성

   • Rep/Cap 플라스미드

   • Helper 플라스미드

   • ITR을 포함한 GOI 벡터

2. 플라스미드 품질 중요

   • OD260/280 = 1.8–2.0

   • 엔도톡신 < 10 EU/μg

3. 플라스미드 비율을 정확히 유지

   • 일반적으로 1:1:1 또는 1:1:2

4. 플라스미드 크기 확인

   • AAV 최대 패키징 용량: 4.7 kb 이하 (ITR 포함)

   • 초과 시 바이러스 생산량 급감.

3. 전사(Transfection) 단계 주의사항

1. 고효율 전사 시약 사용

   • PEI, Lipofectamine 3000 등

2. DNA와 시약 비율 최적화

   • 일반적으로 1–2 μg DNA/cm²

3. 혼합 시 침전(흰색 입자) 발생 주의

   • 침전이 생기면 전사 효율이 크게 떨어짐.

4. 전사 6–8시간 후 배지 교환 권장

   • 독성을 줄이고 생산량 증가.

4. 바이러스 생산 기간 관리

1. 수확 시점:

   • 48–72시간: 1차 수확

   • 96시간: 2차 수확

2. 바이러스 상청액 수집 시 세포층을 교란하지 않기

3. 37°C · 5% CO₂ 안정 유지

4. 세균·진균·마이코플라스마 오염 주의

5. 정제(Purification) 과정 주의사항

(CsCl, PEG, 컬럼 정제, Iodixanol gradient 등)

1. AAV 입자 손상 방지 → 부드럽게 취급

2. 모든 시약·소모품은 무균 및 저엔도톡신 제품 사용

3. Pluronic F-68(0.001–0.01%) 첨가 권장

   • AAV의 튜브 표면 흡착을 방지

4. 정제 전 Benzonase 처리 가능

   • 자유 DNA 제거 → 정확한 vg 측정을 위함

5. 밀도구배 원심분리 시 바이러스 층을 흔들지 않기

6. 바이러스 역가(Titer) 측정 주의사항

(qPCR, ddPCR, ELISA 등)

1. RNase/DNase 처리되지 않은 샘플 사용 금지

2. 표준품(standard)의 정확성 확보

3. qPCR/ddPCR은 보통 ITR 또는 Cap 프라이머 사용

4. vg와 vp의 차이 구분 필수

   • vg: Vector genomes

   • vp: Viral particles

7. 바이러스 보관 주의사항

1. 동결–해동 반복 금지

   • 1회마다 10–30% 역가 감소 가능

2. 소분하여 −80°C 또는 −20°C 보관

3. 0.001–0.01% Pluronic 포함 PBS/HBSS 사용 권장

4. 유리 튜브 사용 금지 (흡착 손실 큼)

8. 자주 발생하는 오류 및 해결법