렌티바이러스 사용 중 발생하는 일반적인 문제

Ⅰ. 패키징(포장) 단계의 일반적인 문제

1. 패키징 효율이 낮거나 바이러스가 생성되지 않음

가능한 원인:

• 트랜스펙션 효율이 낮음 (세포 상태 불량, 시약 문제)

• 플라스미드 비율이 부적절함 (일반적으로 transfer: packaging: envelope = 4:3:1 또는 2:1:1 권장)

• 플라스미드 품질 불량 (내독소가 높거나 농도 부족)

• 세포 밀도가 과도하거나 과융합됨 (70–80% 융합 시 트랜스펙션 권장)

해결 방안:

• 건강하고 증식이 활발한 HEK293T 세포 사용

• 플라스미드 비율 및 트랜스펙션 용량 최적화

• 내독소 제거 고순도 플라스미드 사용

• 각 플라스미드(특히 env, gag/pol)의 정확한 구성 확인

2. 바이러스 역가(titer)가 낮음

가능한 원인:

• 상등액을 너무 일찍 수집함 (보통 48–72시간 후 수집 권장)

• 바이러스가 세포에 흡착되거나 분해됨

• 농축 또는 여과 과정에서 손실 발생

해결 방안:

• 최적의 수집 시점 확인

• 저흡착 튜브 또는 필터 사용

• 필요 시 PEG 침전 또는 초원심분리로 농축

Ⅱ. 감염 단계의 일반적인 문제

1. 감염 효율이 낮거나 형광 신호가 없음

가능한 원인:

• 대상 세포가 렌티바이러스에 감수성이 낮음

• MOI가 너무 낮음

• 바이러스가 부적절하게 보관되어 불활성화됨 (동결–해동 반복 등)

• 감염 보조제(Polybrene, DEAE-Dextran 등) 미사용 또는 농도 부적절

해결 방안:

• MOI를 높이거나 반복 감염 수행

• 적절한 전이 보조제 사용 (예: Polybrene 4–8 µg/mL)

• 세포 밀도 최적화 (50–70% 융합 시 감염 권장)

• 리포터 유전자 발현 시스템 정상 여부 확인

2. 세포 사멸률이 높음

가능한 원인:

• 과도한 바이러스 양 (세포 독성)

• Polybrene 농도가 너무 높음

• 목적 유전자가 세포 독성을 유발

해결 방안:

• MOI 감소 또는 감염 시간 단축

• Polybrene 농도 조정

• 유도형 발현 시스템(Tet-On 등) 사용

Ⅲ. 발현 확인 및 안정주 확립 단계

1. 형광 신호가 늦게 나타남

원인:

• 렌티바이러스는 게놈에 통합 후 발현되므로 시간이 필요함 (보통 48–72시간 후 명확)

대처 방법:

• 72–96시간 후 형광 관찰 또는 항생제 선별 진행

2. 바이러스 장기 보관 후 불활성화

가능한 원인:

• 반복적인 동결–해동 또는 부적절한 보관 온도

해결 방안:

• 분주 후 –80°C에서 보관, 반복 동결–해동 방지

• 필요 시 10% 글리세롤 등의 보호제 첨가

Ⅳ. 기타 주의사항

• 렌티바이러스는 생물안전등급 2 (BSL-2) 수준의 병원체로, 반드시 생물안전 작업대 내에서 취급해야 함

• 직접 접촉 및 에어로졸 흡입 방지

• 모든 폐기물은 고압멸균 후 폐기