AAV 정제 과정에서 응집 감소 방법

AAV(아데노 관련 바이러스) 정제 과정에서 응집을 줄이려면 버퍼 조성, 물리적 스트레스 관리, 올바른 보관 방법 등에 대해 주의를 기울여야 합니다. 다음에서는 AAV 응집을 효과적으로 줄일 수 있는 실용적인 방법들을 소개하겠습니다.

1.버퍼 및 화학 환경 최적화

AAV 입자 간의 정전기적 인력과 소수성 상호작용은 응집의 주요 원인이며, 이를 제어하기 위해서는 버퍼 환경을 최적화하는 것이 중요합니다.

• pH와 이온 강도 조절: AAV 캡시드 표면은 전하를 띠고 있으며, pH가 해당 등전점(pI)에 가까워지면 전하 반발력이 약해져 응집이 쉽게 발생합니다. 버퍼의 pH를 등전점에서 충분히 먼 값(일반적으로 약알칼리성)으로 유지하고, 이온 강도를 적절히 조절하여 염이 전하를 차폐하는 것을 방지해야 합니다.

2.물리적 스트레스 최소화

정제 및 보관 과정에서 가해지는 물리적 외력은 AAV 캡시드 구조를 손상시키고 응집을 유발할 수 있으므로, 이러한 스트레스를 최소화하는 것이 중요합니다.

• 동결-해동 회수 줄이기: 반복적인 동결-해동은 AAV 응집을 촉진하는 가장 큰 원인 중 하나입니다. 이를 방지하기 위해 바이러스 액을 사용할 단위량으로 미리 소량 분할하여 보관하고, 가능하면 일회용으로 사용하는 것이 좋습니다.
• 충격적인 혼합 및 파이펫팅 피하기: 바이러스 현탁액을 혼합할 때는 Vortex 사용을 자제하고, 부드럽게 파이펫팅하여 전단력을 최소화해야 합니다. 또한, 여과 시 과도한 압력을 가하지 않도록 주의해야 합니다.

3.올바른 보관 전략

장기 보관 조건도 AAV의 안정성과 응집 방지에 매우 중요합니다.

저온 보관: AAV는 일반적으로 -80°C에서 장기 보관하며, 이 온도에서 바이러스 활성이 가장 안정적으로 유지됩니다.

적절한 용기 선택: 폴리프로필렌(PP) 또는 저흡착성 코팅이 된 전용 튜브와 같은 표면 흡착이 적은 용기를 사용하면 바이러스 입자가 용기 벽면에 손실되는 것을 막을 수 있습니다.

4.정제 공정 개선

정제 공정 자체를 개선하여 응집체 또는 원치 않는 공정 관련 불순물을 효과적으로 제거할 수도 있습니다.

• 이온 교환 크로마토그래피 활용: 특정 AAV 혈청형(예: AAV5, AAV8)의 경우, 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하면 목적 유전체가 없는 빈 캡시드와 풀(full) 캡시드를 분리하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법을 통해 정제된 AAV 제제에서 풀 캡시드의 비율을 높일 수 있습니다.
• 클로로포름 처리: 일부 연구에서는 AAV가 클로로포름에 대한 내성을 이용한 정제 방법(클로로포름 처리-PEG/NaCl 침전-클로로포름 추출)도 사용되었습니다. 이 방법은 비교적 빠르게 높은 순도의 AAV를 얻을 수 있으나, 방법의 효율과 바이러스 활성에 미치는 영향은 구체적인 조건에 따라 다를 수 있습니다.

5.실험 시 주의사항

• 농도 관리: AAV를 너무 높은 농도로 농축하면 입자 간 충돌 가능성이 높아져 응집 위험이 증가합니다. 필요한 경우 희석하여 사용하는 것이 좋습니다.
• 모니터링: 보관 전후에 용액의 외관(혼탁도, 플레이크 형성 여부)을 확인하고, 가능하다면 역가와 캡시드 완전성을 정기적으로 평가하여 응집 여부를 모니터링해야 합니다.

AAV 정제와 보관 과정에서 이러한 요소들을 주의 깊게 관리한다면, 바이러스 응집을 효과적으로 줄이고 실험의 재현성과 치료제의 효능을 크게 향상시킬 수 있습니다.