아데노연관바이러스의 2플라스미드 시스템과 3플라스미드 시스템의 차이점과 장단점

2플라스미드 시스템: AAV 유전자(Rep/Cap)와 목적 유전자를 하나의 플라스미드에, 도우미 바이러스(아데노바이러스) 유전자를 다른 플라스미드에 담아 두 종류의 플라스미드로 AAV를 생산합니다.

3플라스미드 시스템: AAV 유전자(Rep/Cap), 목적 유전자, 도우미 바이러스 유전자를 각각 별도의 플라스미드로 분리하여 세 종류의 플라스미드로 AAV를 생산합니다.

1. 2플라스미드 시스템 (Two-Plasmid System)

구성

1. AAV 벡터 플라스미드: ITR 사이에 클로닝된 목적 유전자와 AAV의 복제/캡시드 단백질 유전자(Rep/Cap)를 모두 포함합니다.

2. 도우미 플라스미드: AAV의 증식에 필요한 아데노바이러스 유전자(E2A, E4, VA RNA)를 제공합니다.

작동 방식

이 두 플라스미드를 숙주 세포(주로 HEK293 세포)에 동시에 형질주입(transfection)합니다. HEK293 세포는 자체적으로 아데노바이러스 E1 유전자를 보유하고 있어, 플라스미드 B의 도우미 유전자와 상호작용하여 AAV의 효율적인 복제와 패키징을 가능하게 합니다.

2. 3플라스미드 시스템 (Three-Plasmid System) – 현재 표준 방법

구성

1. 벡터 게놈 플라스미드: 두 개의 ITR 사이에 클로닝된 목적 유전자만을 포함합니다.

2. Rep/Cap 플라스미드: AAV의 복제(Rep)와 캡시드(Cap) 단백질 유전자를 포함합니다. Cap 유전자를 교체하여 다양한血清型(Serotype, 예: AAV2, AAV5, AAV9)의 AAV를 생산할 수 있습니다.

3. 도우미 플라스미드: 아데노바이러스 유전자(E2A, E4, VA RNA)를 제공합니다.

작동 방식

이 세 가지 플라스미드를 일정 비율로 혼합하여 숙주 세포(HEK293 등)에 형질주입합니다. 세포 내에서 이 세 요소가 만나 ITR로 정의된 목적 유전자가 Rep/Cap 단백질에 의해 AAV 캡시드 안에 패키징됩니다.

차이점 비교 표

장단점 요약

3플라스미드 시스템의 장점 (2플라스미드 시스템과 비교)

1. 높은 순도: 재조합 AAV(RCA) 생성 위험이 현저히 낮아 더 안전하고 순도 높은 벡터 제제를 생산할 수 있습니다. 이는 임상 적용에 가장 중요한 장점입니다.

2. 뛰어난 유연성: 특정 조직에 특이적인 다양한 AAV血清型(Serotype)으로 쉽게 전환할 수 있어 연구 및 치료 개발에 매우 효율적입니다.

3. 생산 효율성: 형질주입 효율이 더 높고, 높은 역가(Titer)의 AAV를 얻을 수 있습니다.

4. 시스템의 안정성: 각 플라스미드의 크기가 작아 대장균에서의 증식이 안정적이며, 플라스미드 구축이 상대적으로 쉽습니다.

3플라스미드 시스템의 단점

1. 비용 및 복잡성: 플라스미드가 하나 더 필요하므로 초기 플라스미드 구축 및 대규모 GMP 등급 플라스미드 제조 비용이 더 듭니다.

2. 최적화 필요: 세 가지 플라스미드의 최적 비율을 실험적으로 찾아야 최고의 생산 효율을 얻을 수 있습니다.

2플라스미드 시스템의 장점 (현재 관점에서는 제한적)

• 단순성: 플라스미드가 두 개라 형질주입 프로토콜이 약간 더 간단합니다.

2플라스미드 시스템의 단점

• 재조합 위험: 목적 유전자가 Rep/Cap 유전자와 같은 플라스미드에 존재하여, 생산 과정에서 이들이 재조합되어 복제능을 가진 AAV(RCA)가 생성될 위험이 큽니다. 이는 임상적 사용에 큰 걸림돌입니다.

• 유연성 부족: 다른血清型으로 전환하려면 완전히 새로운 벡터 플라스미드를 구축해야 하는 번거로움이 있습니다.

결론

현재 연구실 수준의 기초 연구부터 임상 시험용 GMP 등급 AAV 벡터 생산에 이르기까지 3플라스미드 시스템이 사실상의 표준으로 자리잡았습니다. 그 이유는 재조합 AAV(RCA)의 생성 위험을 극적으로 낮춰 안전성을 확보하면서도, 높은 생산 효율과血清型 전환의 유연성이라는 결정적인 장점을 제공하기 때문입니다. 2플라스미드 시스템은 AAV 생산 기술의 초기 형태로 이해되고 있으며, 특수한 경우를 제외하고는 거의 사용되지 않습니다.