AAV(아데노연관바이러스) 패키징 절차

1. AAV란 무엇인가?

AAV(아데노연관바이러스)는 작은 크기의 비포장 바이러스로, 파보바이러스과에 속합니다. 1965년에 아데노바이러스 분리주의 오염물질에서 처음 발견되었습니다. 외형은 20면체 구조를 가지며, 직경은 약 26nm이고, 캡시드 단백질은 VP1, VP2, VP3의 세 가지로 구성됩니다. AAV의 유전체는 약 4700bp의 단일 가닥 선형 DNA로, 양쪽 끝에 각각 145개의 뉴클레오타이드로 이루어진 T자형 말단 반복 서열(ITR)이 있습니다. ITR은 바이러스 복제의 시작점과 패키징 신호로 작용하며, Rep 유전자는 바이러스 복제와 통합에 관여하는 복제 단백질을, Cap 유전자는 바이러스의 세 가지 캡시드 단백질을 암호화합니다. 자연계에 존재하는 야생형 AAV는 Rep와 Cap 유전자를 포함하고 있지만, 실험용 AAV 벡터는 이를 제거한 재조합 AAV(rAAV)로, ITR 외에는 Rep와 Cap 유전자가 포함되지 않습니다. AAV는 다양한 세로타입이 존재하며, 사람과 원숭이에서 12종이 분리되었습니다. 각 세로타입은 캡시드 구조, 서열, 조직 특이성이 다르며, 이에 따라 세포 수용체와의 상호작용에도 차이가 있어, 감염 효율과 표적 조직이 다릅니다. AAV는 숙주 범위가 넓고, 안전성이 높으며, 면역원성이 낮고, 발현 안정성과 물리적 안정성이 뛰어나기 때문에 기초 연구와 임상 시험에서 널리 사용되며, 세계에서 가장 많이 사용되는 유전자 치료 벡터 중 하나입니다.

2. AAV 패키징

AAV는 결손형 바이러스로, 보조 바이러스(예: 아데노바이러스, 단순포진바이러스)가 없으면 숙주 세포에서 복제 및 조립이 불가능합니다. 보조 바이러스가 없으면 AAV는 숙주 염색체의 19번 염색체에 있는 특정 부위(AAVS1)에 유전체를 통합하여 휴면 상태를 유지합니다. 보조 바이러스가 나타나면 이를 활성화하여 복제와 조립이 이루어집니다.

보조 바이러스가 없는 시스템(AAV Helper-Free System)은 보조 바이러스 없이 재조합 AAV를 생산할 수 있습니다. 이 시스템은 AAV 복제와 발현을 조절하는 아데노바이러스 유전자 산물을 플라스미드로 숙주 세포에 도입하여 사용합니다. 일반적으로 외래 유전자를 포함하는 벡터 플라스미드, Rep와 Cap 단백질을 발현하는 아데노바이러스 보조 플라스미드, Rep와 Cap 단백질을 발현하는 AAV 복제 플라스미드를 함께 트랜스펙션하여 HEK293 세포에 도입한 후, 세포 용해물을 초원심분리하여 고농도의 바이러스를 얻습니다.

AAV2는 현재 가장 널리 사용되는 AAV로, 골격근, 뉴런, 혈관 평활근 세포 및 간 세포에 자연적인 친화성을 보입니다. AAV2는 세 가지 세포 수용체를 가지며, 이들은 각각 HSPG(헤파란황산단백다당류), αVβ5 인테그린, FGFR-1(섬유아세포 성장인자 수용체 1)입니다. HSPG가 주요 수용체로 작용하며, 후자의 두 가지는 공동 수용체로 작용하여 AAV가 수용체 매개 내포작용을 통해 세포로 들어가게 합니다. 주의할 점은 HSPG가 세포외 기질에 풍부하게 존재하면 AAV 입자를 제거하여 감염 효율을 감소시킬 수 있다는 것입니다.

3. AAV 패키징 실험 절차

1. 목적 유전자 확보

2. AAV 벡터 플라스미드 구축 및 시퀀싱: 목적 유전자를 AAV 벡터에 클로닝

3. 벡터 플라스미드, 보조 플라스미드, 패키징 플라스미드를 HEK293 세포에 공트랜스펙션

4. rAAV 원시 바이러스 수집: 원심분리하여 세포 상층액과 침전물을 분리하고, 동결-해동 반복

5. AAV 바이러스 농축 및 정제: PEG8000 농축법 / 자당 밀도 구배 초원심분리법

6. AAV 품질 검사: 바이러스 농도, 플라스미드 잔여물, 숙주 DNA 잔여물, BSA 잔여물, 마이코플라스마, 클라미디아, 내독소, 세균 및 진균 검출 등

4. AAV 패키징의 장단점

장점

1. 안전성 높음: 야생형 AAV는 인체에 병원성을 나타내지 않으며, 재조합 AAV는 세 가지 플라스미드 시스템으로, 유전체 서열에서 대부분의 야생형 AAV 유전자 요소를 제거하고 ITR 서열만 남겨두어 안전성이 더욱 보장됩니다.

2. 면역원성 낮음: AAV2의 유전체는 4681개의 뉴클레오타이드로 구성되어 있어 일반적인 재조합 DNA 기술로 조작이 용이하며, 동물 실험 시 면역 반응이 적고, AAV 감염 조직은 면역 시스템에 의해 제거되는 경우가 드뭅니다.

3. 숙주 범위 넓음: 광범위한 포유류에 감염할 수 있으며, 인간과 비인간 단백질의 발현에 성공적으로 적용되었습니다. 분열 세포뿐만 아니라 비분열 세포에도 감염이 가능합니다.

4. 다양한 세로타입: AAV1~AAV9 및 DJ, DJ/8, Rh10 등 12가지 세로타입이 있으며, 각 세로타입은 다양한 세포와 조직을 표적화할 수 있습니다.

5. 발현 안정성 및 지속 시간 길음: 숙주 유전체에 통합되지 않고, 세포핵 내에 에피좀 형태로 존재하여 체내에서 6개월 이상 지속 발현이 가능합니다.

6. 확산성 강함: 렌티바이러스와 아데노바이러스와 비교하여 AAV는 혈뇌장벽을 통과할 수 있어, 뉴런과 신경아교세포 감염에 가장 적합합니다.

단점

1. 벡터 용량 작음: 삽입 가능한 외래 DNA는 최대 약 3kb로, 렌티바이러스보다 제한적입니다.

2. 체외 실험 발현 수준 낮음: rAAV는 단일 가닥 DNA로, 체외에서 이중 가닥으로 변환되고 외래 유전자를 전사 및 번역하는 효율이 매우 낮습니다. 체외 실험에서 rAAV 바이러스를 감염시키는 동시에 보조 바이러스(예: Ad5형 아데노바이러스)나 10~50mM 농도의 부티르산나트륨을 사용하여 발현량을 증가시킬 수 있습니다.

3. 발현 속도 느림: 렌티바이러스와 아데노바이러스에 비해 rAAV는 감염 후 외래 유전자의 발현이 일반적으로 2주 후에 나타나며, 이는 단일 가닥 DNA가 이중 가닥 DNA로 변환되는 데 시간이 걸리기 때문입니다.

5. AAV 패키징 실험에서 자주 묻는 질문

Q1: 왜 AAV는 세포 감염보다는 동물 실험에 더 적합한가요?

AAV는 세포 감염 시 발현 효율이 낮고, 보조 바이러스나 보조 인자가 없으면 단일 가닥 DNA가 이중 가닥 DNA로 변환되는 과정이 매우 느립니다. 또한, 체외에서 세포 성장 속도가 빨라 감염된 AAV가 세포 분열로 인해 희석되어 발현 수준이 감소합니다. 그러나 동물 실험에서는 다양한 세로타입의 AAV를 사용하여 신경계, 눈, 근육, 간 등 다양한 조직을 특이적으로 표적화할 수 있으며, 정제된 바이러스를 직접 주입하여 높은 감염 효율과 지속적인 발현을 기대할 수 있습니다.

Q2: AAV의 발현 효과는 얼마나 지속되나요?

AAV는 세포 내에서 주로 환형 이중 가닥 DNA(에피좀) 형태로 존재하며, 숙주 세포의 유전체에 통합되지 않습니다. 분열이 적은 세포(예: 뉴런)에서는 AAV가 1년 이상 또는 2년까지 지속 발현할 수 있으며, 분열이 활발한 세포에서도 일반적으로 3~6개월 이상의 지속 발현이 가능합니다.

Q3: AAV는 어떤 분야에 활용되나요?

• 유전자 과발현: 목적 유전자의 CDS 영역을 AAV 벡터에 클로닝하여 동물에 주입하여 과발현을 유도합니다.

• 유전자 간섭 발현: 목적 유전자에 대한 shRNA를 AAV 벡터에 클로닝하여 동물에 주입하여 간섭 발현을 유도합니다.

• 유전자 노크아웃: 목적 유전자에 대한 sgRNA와 Cas9 코딩 서열을 각각 AAV 벡터에 클로닝하여 동물에 주입하여 유전자 노크아웃을 유도합니다.

• 내인성 과발현: 목적 유전자에 대한 sgRNA와 dCas9을 AAV