AAV 포장 시 역가가 낮은 원인은 무엇인가요?

AAV(아데노-관련 바이러스, Adeno-Associated Virus)를 포장할 때 역가(titer)가 낮게 나오는 원인은 여러 단계에서 발생할 수 있습니다. 대표적으로는 플라스미드·트랜스펙션, 생산 세포, 바이러스 조립·수확, 삽입 유전자, 정제·보관, 검출 방법의 여섯 가지로 나눌 수 있습니다.

1. 플라스미드 및 트랜스펙션

• 플라스미드 품질 문제: 엔도톡신 오염, DNA 분해 → 세포 발현 효율 저하

• 플라스미드 비율 불균형: Rep/Cap, Helper, 발현 벡터의 비율이 최적화되지 않음

• 트랜스펙션 효율 저하: DNA 농도 부족, 시약 효능 저하, 세포 상태 불량

2. 생산 세포 상태

• 세포 밀도 부적절: 너무 낮으면 트랜스펙션 효율 저하, 너무 높으면 대사 스트레스 증가

• 세포 건강 악화: 마이코플라스마, 세균 오염 또는 과도한 계대배양

• 세포주 차이: HEK293, HEK293T, HEK293FT 등에서 생산 효율 차이 존재

3. 바이러스 조립 및 수확

• 수확 시점 문제: 보통 48–72시간 후가 최적, 너무 일찍은 입자 형성 부족, 너무 늦으면 분해

• 배지·배양 조건 문제: 혈청 성분 불안정, 영양분 불균형

• 세포 용해 불충분: AAV는 대부분 세포 내 존재 → 동결-해동, 효소 처리 부족 시 역가 감소

4. 삽입 유전자(Insert) 특성

• 유전자 크기 과대: AAV 최대 패키징 용량은 약 4.7 kb, 초과 시 역가 급감

• 유전자 독성: 세포 사멸 유발 → 생산량 감소

• 서열 특이성 문제: 반복 서열, GC 함량 불균형 → 게놈 복제 및 조립 효율 저하

5. 정제 및 보관

• 정제 과정 손실: 아이오덱사놀(碘克沙醇) 구배 원심분리, 컬럼 정제 시 입자 손실

• 보관 조건 불량: 반복 동결-해동, 장기간 4℃ 보관 → 기능적 역가 감소

• 필터 손실: 0.22 μm 필터에 입자 흡착

6. 검출 방법 차이

• qPCR/ddPCR: 게놈 카피 수 검출 → 실제 감염력과 차이

• ELISA: 캡시드 단백질 양만 측정 → 비기능성 입자 포함

• 기능적 역가 측정: 세포 상태, 감염 조건에 따라 결과 낮게 나올 수 있음

7. 최적화 방향

• 고순도·엔도톡신 프리 플라스미드 사용

• 건강한 HEK293 계열 세포 유지 (적절한 밀도)

• 트랜스펙션 조건 최적화 (DNA:시약 비율, 배양 조건)

• 48–72h 내 적절한 수확, 세포 용해 효율 개선

• 삽입 유전자 크기·독성 최소화

• 정제 및 보관 과정에서 손실 최소화