렌티바이러스 포장 시 역가가 낮은 원인은 무엇인가요?

렌티바이러스(Lentivirus)를 포장할 때 역가(titer)가 낮게 나오는 원인은 여러 단계에서 발생할 수 있습니다. 크게 플라스미드·트랜스펙션, 생산 세포, 바이러스 조립·수확, 외래 유전자 특성, 정제·보관, 역가 측정법 여섯 가지 측면으로 정리할 수 있습니다.

1. 플라스미드 및 트랜스펙션 관련

• 플라스미드 품질 불량: 엔도톡신 오염, DNA 분해 → 세포 내 발현 효율 저하

• 플라스미드 비율 불균형: 패키징 벡터(gag/pol, rev, VSV-G)와 발현 벡터의 비율이 최적화되지 않음

• 트랜스펙션 효율 저하: 시약 성능 저하, DNA 농도 불충분, 세포 상태 불량

2. 생산 세포 상태

• 세포 밀도 부적절: 너무 낮으면 트랜스펙션 효율 저하, 너무 높으면 세포 스트레스·사멸 증가

• 세포 건강 불량: 마이코플라스마 오염, 과도한 계대배양 → 바이러스 생산력 저하

• 세포주 차이: HEK293T가 가장 흔히 사용되며 다른 세포주는 생산 효율이 낮을 수 있음

3. 바이러스 조립 및 수확 과정

• 수확 시점 문제: 보통 48–72시간 후 수확이 최적, 너무 일찍은 입자 형성 부족, 너무 늦으면 분해

• 배지 조건 불량: 혈청 성분 불안정, 영양분 부족 등

• 바이러스 방출 미흡: 일부 입자는 세포 내에 잔존 → 세포 용해(동결-해동, 초음파, 효소 처리)가 불충분하면 역가 감소

4. 외래 유전자(Insert) 영향

• 유전자 크기 과대: 렌티바이러스 패키징 용량은 약 8–9 kb, 초과 시 역가 급격히 감소

• 유전자 독성: 세포 생존성 저하 → 생산량 감소

• 서열 특이성 문제: 반복서열, GC 함량 불균형 등이 RNA 합성과 패키징에 악영향

5. 정제 및 보관

• 정제 과정 손실: 초원심분리, 컬럼 정제 중 입자 손실 발생

• 보관 조건 불량: 반복적인 동결-해동, 장기간 4℃ 보관 → 감염력 급감

• 필터링 손실: 0.45 μm 또는 0.22 μm 필터에 일부 바이러스 입자가 흡착

6. 역가 측정법 관련

• 검출 방식 차이: p24 ELISA(캡시드 단백질), qPCR(게놈 수), 기능적 역가(감염 세포 비율) 등 결과 불일치 가능

• 실험 조건 오류: 타겟 세포 상태 불량, 희석 오류, 감염 조건 부적절 → 측정치 낮게 나옴

7. 최적화 방향

• 고순도, 엔도톡신 없는 플라스미드 사용

• 건강한 HEK293T 세포, 최적 밀도 유지

• 트랜스펙션 조건(시약·DNA 비율) 최적화

• 적절한 시점(48–72h)에서 수확, 세포 용해 효율 ↑

• 가능한 한 작은·비독성 삽입 유전자 사용

• 소분 보관하여 동결-해동 최소화