AAV 포장 품질 관리는 어떻게 진행하나요?

1. 바이러스 농도 측정 (滴度 측정)

바이러스 농도는 AAV 포장 품질 관리에서 중요한 지표로, 바이러스 입자의 수를 나타냅니다. 일반적으로 사용되는 농도 측정 방법은 다음과 같습니다:

• qPCR 정량법: 바이러스 벡터의 유전자 복제 수를 측정하는 정량 PCR(qPCR) 방법을 사용하여 AAV 농도를 빠르고 정확하게 측정할 수 있습니다.

• 유세포 분석법: 유세포 분석기를 사용하여 바이러스 입자의 감염 능력을 측정하고, 감염된 세포 수를 통해 바이러스 농도를 계산합니다.

• 세포 전이법: 특수 세포 계열을 감염시킨 후, 감염된 세포 수를 세어 바이러스 농도를 계산합니다.

일반적으로 AAV 포장의 성공을 위해 바이러스 농도는 10^12 – 10^13 vg/ml 범위 내에서 유지해야 합니다.

2. 바이러스 순도 분석

바이러스 순도는 AAV의 효율성과 안전성에 큰 영향을 미칩니다. 순도 분석 방법은 다음과 같습니다:

• 원심분리법 (초속도 원심분리): 원심분리를 통해 세포 잔해, 비포장된 바이러스 플라스미드 및 기타 불순물을 제거합니다. 밀도 구배 원심분리(예: NaCl 구배)를 사용하여 바이러스를 정제할 수 있습니다.

• 겔 전기영동: 아가로스 겔 전기영동을 통해 AAV 바이러스 DNA의 크기와 완전성을 검사하여 유전자 삽입 오류나 불순물이 없는지 확인합니다.

• SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯: 바이러스 입자의 단백질 구성을 확인하고, 불필요한 단백질 오염이 없는지 검사합니다.

3. 바이러스 완전성과 구조 분석

AAV 바이러스의 유전자 서열이 완전하고 돌연변이나 결함이 없는지 확인하는 과정입니다:

• PCR 증폭 및 시퀀싱: 바이러스 유전자를 PCR로 증폭하고 시퀀싱하여 목표 유전자가 AAV 입자 내에 완전하게 포장되어 있는지 확인합니다.

• 플라스미드 맵 분석: 플라스미드 맵 분석을 통해 포장 과정에서 불량한 유전자 재조합이나 돌연변이가 발생하지 않았는지 확인합니다.

• 전자 현미경 검사: 전자 현미경(EM)을 사용하여 AAV 바이러스 입자의 형태를 관찰하고, 형태에 이상이 없는지 확인합니다.

4. 무균성 및 내독소 검사

AAV 바이러스의 무균성 및 내독소 수준을 검사하여 안전성을 확인합니다:

• 무균성 검사: 표준 배지에서 배양하여 AAV 바이러스 샘플이 세균이나 진균에 오염되지 않았는지 검사합니다. 일반적으로 포장 후 24-48시간 내에 검사합니다.

• 내독소 검사: 내독소 수치를 검사하기 위해 LAL(림불루스 아메보사이트 리세이트) 테스트 키트를 사용합니다. 내독소 수준이 초과되면 면역 반응을 일으킬 수 있기 때문에 내독소 수치는 ≤5 EU/mL로 엄격히 관리해야 합니다.

5. AAV 바이러스의 안정성 테스트

AAV 바이러스의 안정성은 장기 보관 및 운송 후에도 바이러스가 효율적으로 작용할 수 있도록 보장합니다:

• 냉동 저장 테스트: AAV 바이러스 샘플을 -80°C에서 보관하고, 보관 후 바이러스 농도를 측정하여 동결 저장이 바이러스에 미치는 영향을 평가합니다.

• 동결건조 안정성: 동결건조된 AAV 바이러스를 상온에서 보관한 후, 재용해 후 농도를 측정하여 동결건조 과정이 바이러스에 미친 영향을 평가합니다.

• 온도 및 광선 안정성: 다양한 온도와 광선 조건에서 AAV 바이러스의 안정성을 테스트하여, 최적의 저장 및 운송 조건을 설정합니다.

6. AAV 바이러스 전도 효율 테스트

전도 효율은 AAV 포장의 품질을 평가하는 중요한 지표로, 바이러스가 목표 세포를 성공적으로 감염시킬 수 있는 능력을 나타냅니다:

• 유세포 분석: 유세포 분석기를 사용하여 감염된 세포의 비율을 측정하고, GFP(녹색 형광 단백질) 또는 다른 보고 유전자의 발현 수준을 통해 전도 효율을 평가합니다.

• 형광 현미경 검사: GFP와 같은 보고 유전자의 발현을 형광 현미경으로 관찰하여 전도 효율을 확인합니다.

• PCR로 전도 후 유전자 발현 검사: 감염된 세포에서 DNA 또는 RNA를 추출하고 PCR을 통해 목표 유전자의 발현 여부를 확인합니다.

7. AAV 바이러스의 안전성 검사

AAV 바이러스가 유전자 치료에 사용될 때, 안전성을 보장하는 과정이 필요합니다:

• 숙주 세포의 유전자 물질 오염: AAV 바이러스 내에 숙주 세포의 유전자 물질이 포함되지 않도록 확인하여, 유전자 오염을 방지합니다.

• 바이러스 벡터의 면역원성: AAV 바이러스의 면역원성을 확인하여 임상 적용에서 면역 반응을 일으키지 않도록 합니다.

• 장기 노출 후 독성 검사: AAV 바이러스가 세포에 미치는 독성을 평가하기 위해 장기 세포 독성 검사를 수행합니다.

AAV 포장의 품질 관리는 바이러스 농도, 순도, 완전성, 안정성, 무균성, 내독소 및 전도 효율 등을 포함한 여러 측면을 평가하여 바이러스의 효율성과 안전성을 보장합니다. 철저한 품질 관리를 통해 AAV 바이러스가 실험 연구와 임상 응용에서 안정적으로 작용할 수 있도록 할 수 있습니다.