AAV 패키징은 성공했는데 발현이 되지 않는 이유는? 반드시 확인해야 할 6가지 사항

AAV 패키징이 완료되고 바이러스까지 공급받았지만, 세포 또는 동물실험에서 목적 유전자의 발현이 확인되지 않는 경우가 있습니다.

그러나 발현이 확인되지 않는다고 해서 곧바로 AAV 제조 과정의 문제라고 판단해서는 안 됩니다. 벡터 설계, 바이러스 품질, 표적 조직, 투여 조건 및 검출 방법 등 여러 요인을 순서대로 점검해야 합니다.

1. 유전체 역가와 실제 사용한 바이러스 양

먼저 AAV의 유전체 역가와 실제 실험에 사용한 총 유전체 수를 확인해야 합니다.

총 유전체 수는 다음과 같이 계산할 수 있습니다.

총 유전체 수(vg) = 유전체 역가(vg/mL) × 사용 부피(mL)

단, vg(vector genomes)는 바이러스 유전체 복제 수를 나타내는 지표이며, 감염성이나 기능적 발현 능력을 직접적으로 나타내지는 않습니다. 따라서 유전체 역가만으로 실험 결과를 판단해서는 안 됩니다.

2. AAV 혈청형이 표적 세포 및 조직에 적합한가?

AAV 혈청형에 따라 세포와 조직에 대한 전달 특성이 달라질 수 있습니다.

특정 혈청형이 한 동물 모델에서 효과적이었다고 해서 다른 동물 종이나 계통, 투여 경로에서도 동일한 결과를 보장하는 것은 아닙니다.

다음 사항을 확인해 보세요.

• 사용한 동물 종 및 계통
• 표적 조직 또는 세포
• 투여 경로
• 관련 선행 연구의 실험 조건
• 해당 AAV 혈청형을 선택한 근거

3. 프로모터가 표적 세포에 적합한가?

AAV가 세포에 전달되더라도 사용한 프로모터가 표적 세포에서 충분히 작동하지 않으면 목적 유전자의 발현이 검출되지 않을 수 있습니다.

대표적인 프로모터는 다음과 같습니다.

• CAG: 다양한 세포에서 발현을 유도하기 위해 고려
• CMV: 여러 세포 시스템에서 활용되는 프로모터
• EF1α: 다양한 세포에서 발현을 유도하는 데 활용
• hSyn: 신경세포 발현을 목적으로 할 때 고려
• GFAP: 성상교세포 관련 연구에서 고려
• TBG: 간세포 발현을 목적으로 할 때 고려

단, 각 프로모터의 발현 특성은 동물 종, 조직 및 실험 조건에 따라 달라질 수 있습니다.

4. 발현 카세트 설계에 문제가 없는가?

GOI 서열, 삽입 방향, 시작 및 종결 코돈, 프로모터와의 연결 상태, PolyA 등 발현 카세트의 구성 요소를 확인해야 합니다.

또한 AAV의 탑재 용량을 초과하지 않았는지도 중요합니다. 일반적인 단일가닥 AAV의 유전체 탑재 용량은 약 4.7 kb이므로 전체 발현 카세트의 길이를 고려해야 합니다.

필요하다면 플라스미드 서열, ITR 상태 및 삽입 서열의 완전성도 확인해야 합니다.

5. AAV 품질 지표 확인

AAV의 품질은 유전체 역가만으로 평가할 수 없습니다.

주요 확인 항목은 다음과 같습니다.

• 유전체 역가
• 캡시드 역가
• 유전체 완전성
• 빈 캡시드 및 충전 캡시드 비율
• 순도 및 응집 상태
• 엔도톡신
• 숙주세포 유래 불순물

각 항목은 서로 다른 품질 특성을 평가합니다. 하나의 수치만으로 AAV의 전체 품질을 판단하지 않는 것이 중요합니다.

6. 투여·배양 조건과 발현 검출 방법 확인

AAV 발현은 투여량, 투여 경로, 관찰 시점, 세포 상태, 배양 조건 및 검출 방법 등에 영향을 받을 수 있습니다.

예를 들어 발현을 확인하기에 관찰 시점이 너무 이르거나 검출 방법의 민감도가 충분하지 않으면 발현이 확인되지 않을 수 있습니다.

다음 사항을 점검해 보세요.

• AAV의 보관, 해동 및 취급 조건
• 투여량 및 투여 경로
• 배양 세포 상태 및 실험 모델
• 발현 확인까지의 시간
• 형광현미경, Western blot, qPCR 등 검출 방법
• 양성 및 음성 대조군 설정

PackGene AAV 패키징 및 품질 분석 서비스

PackGene은 AAV 벡터 설계, 플라스미드 제작, AAV 패키징, 정제 및 품질 분석까지 연구 프로젝트에 맞춘 서비스를 제공합니다.

AAV 발현 문제를 검토할 때는 벡터 구조, 혈청형, 유전체 역가 및 유전체 완전성 등의 정보를 종합적으로 확인하는 것이 중요합니다.

PackGene은 연구 목적에 맞는 AAV 제작 및 품질 분석 서비스에 대해 상담을 지원합니다.

AAV를 사용했지만 목적 유전자의 발현이 확인되지 않나요? 벡터 설계와 품질 데이터를 함께 검토하여 원인을 체계적으로 파악하는 것이 중요합니다. AAV 패키징 및 품질 분석 서비스에 대해 PackGene에 문의해 보세요.

자주 묻는 질문(FAQ)

Q1. AAV 유전체 역가가 높은데도 발현이 되지 않는 이유는 무엇인가요?

유전체 역가는 바이러스 유전체 복제 수를 나타내며, 실제 전달 효율이나 발현량을 직접적으로 보장하지 않습니다. 혈청형, 프로모터, 벡터 구조 및 실험 조건을 함께 확인해야 합니다.

Q2. AAV 투여 후 얼마 만에 발현을 확인할 수 있나요?

발현 확인 시점은 혈청형, 표적 조직, 투여 경로, 실험 모델 및 발현 카세트 등에 따라 달라집니다. 모든 실험에 적용되는 단일한 관찰 시점은 없습니다.

Q3. 발현이 확인되지 않을 때 가장 먼저 무엇을 점검해야 하나요?

먼저 벡터 서열과 프로모터, 혈청형과 표적 조직의 적합성, 실제 사용한 바이러스 양, 품질시험성적서 및 검출 방법을 순서대로 확인하는 것이 좋습니다.