AAV의 qPCR 역가는 정상인데 기능적 역가(Functional Titer)가 낮은 이유는 무엇일까요? 원인과 최적화 전략

AAV(Adeno-Associated Virus, 아데노연관바이러스)의 생산, 품질 평가 및 연구 과정에서 qPCR로 측정한 바이러스 역가(vg/mL)는 충분히 높지만 실제 세포 감염 효율이나 동물 모델에서의 유전자 발현이 기대보다 낮은 경우를 자주 경험할 수 있습니다.

이러한 현상은 물리적 역가(Physical Titer)와 기능적 역가(Functional Titer)는 서로 동일한 개념이 아니라는 점을 보여줍니다.

qPCR 역가는 바이러스 입자에 포함된 벡터 유전체(Vector Genome)의 수를 의미하는 반면, 기능적 역가는 실제로 표적 세포에 감염되어 세포 내로 유입되고, 핵으로 이동하여 목적 유전자를 정상적으로 발현할 수 있는 생물학적으로 활성화된 바이러스 입자의 수를 반영합니다.

따라서 qPCR 역가가 높다고 해서 반드시 높은 형질도입 효율(Transduction Efficiency)이나 우수한 유전자 발현을 보장하는 것은 아닙니다.

이번 글에서는 AAV의 qPCR 역가는 정상인데 기능적 역가가 낮게 나타나는 주요 원인과 이를 개선하기 위한 방법을 자세히 살펴보겠습니다.

AAV qPCR 역가란 무엇인가?

현재 AAV 역가 측정에는 qPCR과 ddPCR이 가장 널리 사용됩니다.

일반적으로 다음과 같은 서열을 대상으로 정량합니다.

• ITR
• WPRE
• PolyA
• GOI(목적 유전자)

결과는 일반적으로 vg/mL(Vector Genome per Milliliter) 단위로 표시됩니다.

이는 시료에 존재하는 벡터 유전체의 개수를 의미할 뿐이며, 바이러스의 감염 능력, 캡시드의 품질 또는 목적 유전자의 발현 능력을 직접 평가하는 지표는 아닙니다.

따라서 AAV의 품질을 평가할 때는 qPCR 역가만으로 판단해서는 안 되며, 여러 품질 평가 지표를 함께 고려하는 것이 중요합니다.

qPCR 역가는 정상인데 기능적 역가가 낮은 주요 원인

1. Empty Capsid 비율이 높고 Full Capsid 비율이 낮은 경우

기능적 역가가 낮아지는 가장 흔한 원인 중 하나는 Empty Capsid(빈 캡시드)의 비율이 높은 경우입니다.

Empty Capsid에는 벡터 유전체가 포함되어 있지 않기 때문에 qPCR에서는 검출되지 않습니다. 그러나 세포 표면 수용체에는 결합할 수 있으므로, 실제 유전자를 포함한 Full Capsid와 경쟁하여 세포 감염 효율을 떨어뜨릴 수 있습니다.

또한 Empty Capsid가 과도하게 많으면 체내 투여 시 면역반응을 증가시킬 가능성도 있습니다.

2. 벡터 유전체가 완전하게 패키징되지 않은 경우

qPCR은 유전체 전체가 아니라 특정 서열만을 증폭하여 정량합니다.

따라서 다음과 같은 문제가 발생해도,

• 유전체 일부 결실(Truncated Genome)
• ITR 손상
• 불완전한 패키징
• 비정상적인 재조합

qPCR 프라이머가 결합하는 영역만 남아 있다면 정상적인 역가로 측정될 수 있습니다.

그러나 실제로는 완전한 발현 카세트가 형성되지 않아 목적 유전자의 발현이 크게 감소하게 됩니다.

특히 AAV의 최대 적재 용량에 가까운 벡터에서는 이러한 문제가 더욱 자주 발생합니다.

3. 캡시드 품질 저하

AAV의 감염 과정은 정상적인 캡시드 구조에 크게 의존합니다.

예를 들어,

• VP1 함량 감소
• VP1/VP2/VP3 비율 이상
• 캡시드 구조 손상
• 반복적인 동결·해동
• 4℃에서 장시간 보관

등은 세포 수용체 결합, 세포 내 유입, 엔도좀 탈출 및 핵 이동 효율을 저하시킬 수 있습니다.

이 경우 qPCR에서는 높은 역가가 측정되더라도 실제 형질도입 효율은 크게 감소합니다.

4. 목적 조직에 적합하지 않은 혈청형(Serotype) 선택

AAV 혈청형마다 서로 다른 조직 친화성(Tropism)을 가지고 있습니다.

대표적으로,

• AAV8: 간
• AAV9: 중추신경계, 심장 및 전신 전달
• AAV6: 골격근
• AAV2: 안과 연구

등이 널리 사용됩니다.

목적 조직에 적합하지 않은 혈청형을 선택하면 qPCR 역가가 높더라도 원하는 유전자 전달 효율을 얻기 어렵습니다.

5. 프로모터 활성이 충분하지 않은 경우

qPCR 결과는 프로모터의 영향을 받지 않지만, 실제 유전자 발현은 프로모터 활성에 크게 좌우됩니다.

대표적인 프로모터는 다음과 같습니다.

• CAG
• EF1α
• hSyn
• GFAP
• Albumin

특히 CMV 프로모터는 일부 세포나 조직에서 발현이 억제(silencing)될 수 있으므로, 바이러스가 세포 내로 성공적으로 전달되더라도 충분한 발현이 이루어지지 않을 수 있습니다.

6. 발현 카세트 설계에 문제가 있는 경우

벡터 설계가 적절하지 않으면 기능적 역가도 크게 감소할 수 있습니다.

예를 들어,

• ORF 돌연변이
• Kozak 서열 결실
• Reading Frame 오류
• PolyA 이상
• WPRE 결실
• 코돈 최적화 부족
• 조절 서열 설계 미흡

등은 전사 및 번역 효율을 떨어뜨려 최종 단백질 발현량을 감소시킵니다.

7. 보관 및 운송 조건이 적절하지 않은 경우

AAV는 보관 및 취급 조건에 민감합니다.

다음과 같은 상황은 바이러스 활성을 저하시킬 수 있습니다.

• 반복적인 동결·해동
• 과도한 흔들림
• 4℃에서 장시간 보관
• 운송 중 온도 변화
• 반복적인 피펫팅

이러한 경우 벡터 유전체는 그대로 남아 있기 때문에 qPCR 역가는 크게 변하지 않지만, 실제 감염 능력은 크게 감소할 수 있습니다.

8. 실험 조건이 최적화되지 않은 경우

기능적 역가는 바이러스 자체의 품질뿐 아니라 실험 조건에도 영향을 받습니다.

예를 들어,

• MOI가 너무 낮은 경우
• 감염 시간이 충분하지 않은 경우
• 발현 평가 시점이 너무 이른 경우
• 표적 세포의 수용체 발현이 낮은 경우
• 세포 상태가 좋지 않은 경우
• in vivo에서 중화항체가 존재하는 경우

등은 실제 형질도입 효율을 크게 떨어뜨릴 수 있습니다.

AAV의 품질은 어떻게 종합적으로 평가해야 할까요?

AAV의 품질은 qPCR 역가만으로 판단해서는 안 되며, 다음과 같은 다양한 평가 지표를 함께 확인하는 것이 권장됩니다.