LNP 봉입률이 낮을 때, 어디에 문제가 있을까?

mRNA 전달 연구에서 LNP(지질 나노입자)는 이미 주요 전달 플랫폼 중 하나로 자리 잡았습니다. 백신 개발, 단백질 발현, 유전자 치료 관련 연구 등 어떤 분야에서든 LNP의 제조 품질은 이후 실험 결과에 직접적인 영향을 미칩니다. 그중에서도 봉입률(Encapsulation Efficiency, EE)은 LNP의 품질을 평가하는 중요한 지표입니다.

연구 현장에서는 입자 크기와 PDI는 정상적으로 보이지만, 봉입률만 지속적으로 낮거나 배치 간 변동이 큰 경우가 종종 발생합니다. 이런 상황에서는 먼저 장비 문제나 작업 오류를 의심하기 쉽지만, 실제로 LNP 봉입률 저하는 단일 원인으로 발생하는 경우가 드뭅니다. RNA 품질, 지질 조성, 혼합 공정, 제조 환경, 그리고 후처리 및 분석 방법이 복합적으로 작용한 결과인 경우가 많습니다.

1. mRNA 품질이 가장 먼저 확인해야 할 요인일 수 있다

LNP 형성에는 RNA와 이온화 지질(ionizable lipid) 간의 효과적인 복합체 형성이 필요합니다. 따라서 RNA 자체의 품질은 봉입의 기본 조건을 결정합니다.

가장 먼저 확인해야 할 것은 mRNA가 분해되었는지 여부입니다. RNA는 RNase에 매우 민감하기 때문에, 시료 보관이 적절하지 않거나 동결-해동을 반복했거나 실험 환경에 RNase 오염이 존재한다면 RNA가 단편화될 수 있습니다. mRNA 분해는 RNA의 길이 분포, 구조, 전하 분포를 변화시켜 처음 설계한 지질/RNA 비율과 맞지 않게 만들 수 있으며, 그 결과 복합체 형성, 입자 형성 및 최종 봉입 결과에 영향을 줄 수 있습니다.

완전성뿐만 아니라 RNA 순도도 중요합니다. IVT 전사 후 주형 DNA, dsRNA, 단백질 잔류물, 염류 또는 반응 부산물이 많이 남아 있으면 지질의 자가조립 과정을 방해하여 최종 봉입 효율에 영향을 줄 수 있습니다.

또한 RNA 길이와 투입 농도도 무시할 수 없습니다. 많은 mRNA-LNP 시스템에서 긴 mRNA는 안정적이고 높은 효율의 봉입을 얻기가 더 어려운 경우가 많으며, 지질/RNA 비율, 완충 조건, 혼합 파라미터를 별도로 최적화해야 할 수 있습니다. RNA 투입량이 너무 많으면 지질 시스템의 적재 용량을 초과하여 일부 RNA가 효과적으로 봉입되지 않을 수 있습니다.

2. 지질 비율이 적절하지 않으면 “제대로 감싸지 못하는” 문제가 생길 수 있다

LNP 봉입의 핵심 메커니즘 중 하나는 이온화 지질과 RNA 인산 골격 사이의 정전기적 상호작용입니다. 따라서 지질 조성 설계는 봉입 효율에 직접적인 영향을 미칩니다.

그중 가장 자주 논의되는 파라미터가 N/P 비율(Nitrogen/Phosphate ratio) 입니다.

N/P 비율이 너무 낮으면 시스템 내 양성자화 가능한 질소가 상대적으로 부족해 RNA를 충분히 압축하고 복합화하지 못할 수 있습니다. 그 결과 유리 RNA가 증가하여 봉입률이 낮아질 수 있습니다.

하지만 N/P 비율이 높을수록 항상 좋은 것은 아닙니다. 지질 비율을 높이면 봉입률이 향상될 수 있지만, 동시에 입자 크기 증가, PDI 상승, 유리 지질 증가, 세포독성 증가 또는 형질주입 효율 저하와 같은 문제가 발생할 수 있습니다. 따라서 봉입률 최적화는 봉입 효율, 입자 안정성, 전달 성능 사이의 균형을 찾는 과정입니다.

N/P 비율 외에도 다음과 같은 지질 조성이 봉입 결과에 영향을 줄 수 있습니다.

• 이온화 지질(ionizable lipid)의 비율
• 콜레스테롤(cholesterol) 함량
• DSPC 또는 DOPE 등 보조 지질의 비율
• PEG-lipid 함량

이러한 성분들은 LNP의 구조적 안정성, 입자 크기 분포, 표면 특성 및 전달 성능을 종합적으로 결정합니다.

3. 많은 봉입 문제는 사실 혼합 공정에서 비롯된다

실제 실험에서는 조성에 더 많은 관심을 두는 경우가 많지만, 혼합 과정의 중요성이 간과되는 경우도 적지 않습니다.

LNP는 단순히 “섞는 것”만으로 형성되는 것이 아니라, 용매 환경의 빠른 변화와 분자 간 상호작용을 통해 짧은 시간 안에 자가조립됩니다. 따라서 혼합 동역학에 매우 민감합니다.

마이크로플루이딕스를 이용한 제조를 예로 들면, 일반적으로 다음 두 가지 파라미터가 봉입률에 큰 영향을 줍니다.

1. FRR: 유량비

FRR(Flow Rate Ratio)은 일반적으로 수상과 유기상의 유량 비율을 의미합니다.

FRR은 수상과 유기상의 부피비, 에탄올 희석 속도, 국소 용매 환경, pH 변화 및 지질 석출 과정에 영향을 미칩니다. 따라서 LNP의 입자 크기, PDI 및 봉입률에 큰 영향을 줄 수 있습니다.

FRR이 적절하지 않으면 에탄올이 적절한 시간 범위 내에서 희석되지 못하고, 지질 석출 및 RNA 복합화 과정이 영향을 받을 수 있습니다. 그 결과 빈 입자, 봉입이 부족한 LNP, 또는 입자 크기와 PDI 이상이 나타날 수 있습니다.

2. TFR: 총 유량

TFR(Total Flow Rate)은 혼합 강도와 혼합 시간에 영향을 줍니다.

총 유량이 너무 낮으면 혼합 효율이 떨어지고, 지질과 RNA의 접촉 및 자가조립 과정이 균일하지 않게 진행될 수 있습니다. 그 결과 입자 분포가 불균일해지고, PDI가 증가하며, 봉입률이 낮아질 수 있습니다.

다만 TFR 역시 높을수록 항상 좋은 것은 아닙니다. 지나치게 높은 유량은 시스템 압력 상승, 전단력 영향, 장비 불안정성 또는 스케일업의 어려움을 초래할 수 있습니다. 따라서 칩 구조, 시스템 점도, 목표 입자 크기를 고려해 최적화해야 합니다.

또한 사소해 보이는 장비 문제도 원인이 될 수 있습니다.

• 마이크로플루이딕 칩 오염
• 유로 또는 튜빙 막힘
• 펌프 유량 불안정
• 시스템 데드 볼륨 과다
• 튜빙 또는 커넥터 차이로 인한 혼합 지연

동일한 조성에서도 배치 간 봉입률 변동이 크다면, 조성 최적화뿐 아니라 장비 상태가 안정적인지도 확인해야 합니다.

4. pH 조건이 맞지 않으면 LNP 형성에 직접적인 영향을 줄 수 있다

LNP 형성은 일반적으로 산성 환경에 의존합니다.

제조 단계에서는 acetate buffer 또는 citrate buffer와 같은 산성 완충액을 사용하는 경우가 많으며, 일반적으로 pH 4 전후가 사용됩니다. 이는 이온화 지질을 충분히 양성자화하여 양전하를 띠게 하고, RNA와 효율적으로 결합하도록 하기 위한 것입니다.

하지만 최적 pH는 고정된 값이 아니며, 이온화 지질의 pKa, RNA 종류, 완충 시스템 및 제조 공정에 따라 달라질 수 있습니다.

다음과 같은 문제가 있으면,

• 완충액 pH 설정 오류
• 산성도 부족
• 완충 능력 불안정
• pH 미터 교정 불량
• 혼합 후 실제 pH가 예상값에서 벗어남

이온화 지질의 양성자화가 충분하지 않아 RNA 결합 능력이 떨어지고, 최종적으로 봉입률이 낮아질 수 있습니다.

따라서 pH는 단순한 완충 조건이 아니라, LNP 자가조립과 RNA 복합화 효율에 영향을 주는 중요한 요소입니다.

5. 지질과 용매 상태도 최종 결과에 영향을 준다

때로는 문제가 RNA나 공정이 아니라 원료 자체에 있을 수 있습니다.

LNP 제조에서는 지질과 용매의 상태에 대한 품질 관리도 중요합니다. 예를 들어 일부 이온화 지질, 보조 지질 또는 PEG-lipid는 장기 보관, 반복적인 동결-해동, 빛 노출, 산화 조건에서 분해될 수 있으며, 이로 인해 시스템 안정성과 봉입 성능이 저하될 수 있습니다.

에탄올 품질도 중요하게 확인해야 합니다. 지질은 일반적으로 에탄올상에 용해되므로, 에탄올 순도가 낮거나 흡습이 발생하거나 휘발로 인해 농도가 변하거나 지질이 완전히 용해되지 않으면, 시스템 극성과 지질 석출 거동이 달라져 자가조립 과정에 영향을 줄 수 있습니다.

이러한 요인들은 쉽게 간과되지만, 실제 실험에서는 드물지 않게 발생합니다.

6. 봉입률이 낮게 “보이는” 것일 수도 있다

봉입률이 낮다고 해서 반드시 LNP 제조가 실패했다는 의미는 아닙니다.

문제가 후처리나 분석 단계에 있을 수도 있습니다.

예를 들어 투석, 한외여과 또는 TFF를 이용한 버퍼 교환 과정에서 다음과 같은 일이 발생할 수 있습니다.

• LNP 구조 재배열
• RNA 누출
• 입자 흡착 또는 손실
• 총 RNA 회수율 감소
• 국소 pH 또는 삼투압 변화로 인한 입자 안정성 저하

이러한 요인들은 최종적으로 측정되는 EE와 RNA recovery에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 봉입률을 판단할 때는 봉입률뿐 아니라 총 RNA 회수율도 함께 확인하는 것이 좋습니다.

또한 분석 방법에 따라 결과가 달라질 수 있습니다.

• RiboGreen 또는 PicoGreen 분석법
• 용해/비용해 대조군 분석
• 표준곡선 오차
• 시료 희석 오차
• 용해제 농도 부족으로 인한 LNP 불완전 파괴
• 지질, 에탄올, 계면활성제 또는 완충염에 의한 형광 신호 간섭
• 표준곡선 매트릭스와 시료 시스템의 불일치

따라서 실험 결과가 비정상적으로 나타날 경우, 조성과 공정을 최적화하는 것뿐 아니라 분석법 자체의 신뢰성도 확인해야 합니다. 그렇지 않으면 봉입률이 “가짜로 낮게” 또는 “가짜로 높게” 측정될 수 있습니다.

마무리

LNP 봉입률 저하는 단일 요인으로 발생하는 경우가 많지 않습니다. 연구자에게 중요한 것은 조성을 반복적으로 바꾸는 것이 아니라, 체계적인 문제 해결 관점을 갖는 것입니다.

일반적으로는 다음 순서로 점검할 수 있습니다.

1. 먼저 mRNA의 완전성과 순도가 적절한지 확인한다.
2. 그다음 지질 비율, N/P 비율, RNA 투입량이 적절한지 확인한다.
3. 이후 FRR, TFR, 장비 상태 등 마이크로플루이딕 혼합 조건을 점검한다.
4. 추가로 pH 환경, 완충 능력, 혼합 후 실제 조건을 확인한다.
5. 지질과 에탄올 등 원료 상태를 확인한다.
6. 마지막으로 후처리 과정과 분석 방법이 결과에 편향을 주는지 평가한다.

많은 경우 봉입률에 영향을 주는 것은 하나의 “큰 실수”가 아니라 여러 작은 요인이 누적된 결과입니다. 이러한 핵심 단계를 하나씩 점검하면 무작정 시행착오를 반복하는 것보다 훨씬 효율적으로 원인을 파악할 수 있습니다.

요약하면, 적절한 N/P 비율, 올바른 산성 pH, 안정적이고 빠른 혼합 과정, 그리고 신뢰할 수 있는 RNA와 분석 방법이 높은 봉입률을 보이는 mRNA-LNP를 얻기 위한 핵심 조건입니다。