AAV 초원심분리 밴드에서 흔히 발견되는 불순물 분석

아데노부속바이러스(AAV) 제조 과정에서 CsCl 또는 Iodixanol 밀도 구배를 이용한 초원심분리는 가장 널리 사용되는 정제 방법 중 하나이다. 이 방법은 입자의 밀도 차이를 기반으로 바이러스를 분리하며, 원심분리 후 튜브 내에서 뚜렷한 밴드를 관찰할 수 있다.

그러나 관찰되는 밴드가 모두 유효한 AAV 입자를 의미하지는 않는다. 목표 밴드 및 인접 영역에는 다양한 비이상적 성분이 함께 존재할 수 있으며, 이러한 불순물의 특성을 이해하는 것은 AAV 품질 평가와 실험 결과 해석에 매우 중요하다.

1. 밴드에서 가장 흔한 불순물 유형

1) 빈 캡시드 AAV (Empty capsid)

빈 캡시드 AAV는 초원심분리 밴드에서 가장 흔하게 발견되는 불순물이다.
구조적으로는 완전한 AAV와 동일하지만, 바이러스 유전체를 포함하지 않는다.

• 목적 유전자 발현 불가

• 유효 감염 입자 비율 감소

• in vivo 실험에서 면역 반응 위험 증가 가능

2) 부분 포장 AAV (Partial genome particles)

부분 포장 AAV는 불완전하거나 절단된 유전체를 포함한 입자를 의미한다.

• 삽입 유전자가 AAV 포장 한계에 근접 또는 초과한 경우

• ITR 구조 이상 또는 재조합 발생 시 흔함

이러한 입자는 qPCR 상의 vg 값은 정상적으로 보일 수 있으나, 실제 발현 효율은 낮은 경우가 많다.

3) 오포장 DNA (Mis-packaged DNA)

AAV 캡시드는 목표 유전체 외에도 다음과 같은 DNA를 잘못 포장할 수 있다.

• 플라스미드 백본 서열

• 숙주 세포 유전체 DNA

• helper plasmid 유래 서열

이들 불순물은 밀도가 완전 AAV와 유사하여 밴드 위치만으로는 구분이 어렵고, in vivo 또는 임상 전 연구에서 생물안전성 측면의 우려가 있다.

2. 밴드 외에 동반될 수 있는 불순물

4) 숙주 세포 단백질 (HCP)

초원심분리 후에도 일부 숙주 세포 단백질이 잔존할 수 있으며, 이는 AAV 표면에 흡착되어 존재하는 경우가 많다.

5) 유리 핵산 (DNA / RNA)

세포 용해 또는 뉴클레아제 처리 부족 시 유리 핵산이 남아 다음과 같은 문제를 유발할 수 있다.

• 구배 점도 증가

• 밴드 흐림 또는 테일링

• 정량 정확도 저하

3. 초원심분리 시스템별 밴드 분포 특징

Iodixanol 구배

• 15%–25%: 단백질 파편 및 경량 불순물

• 25%–40%: 빈 캡시드 AAV

• 40%–60% 경계: 완전한 AAV (목표 밴드)

• 60% 이하: 고밀도 불순물 또는 응집체

CsCl 구배

• 빈 캡시드, 부분 포장, 완전 AAV를 보다 명확히 분리 가능

• 단, 공정 시간이 길고 바이러스 활성에 영향을 줄 수 있음

4. AAV 품질 평가에 대한 권장 사항

AAV 품질 평가는 밴드 관찰만으로는 충분하지 않으며, 다음과 같은 지표를 함께 고려하는 것이 바람직하다.

• 바이러스 유전체 정량(vg)

• 캡시드 수 또는 vg/capsid 비율

• 체외 또는 생체 내 발현 결과

결론

AAV 초원심분리 밴드에서 가장 주요한 불순물은 빈 캡시드와 비정상적으로 포장된 입자이다.

밴드는 밀도 분포만을 반영하며, 바이러스의 기능적 유효성을 직접적으로 의미하지 않는다.

정확한 AAV 품질 평가는 정량 분석과 기능 검증을 병행해야 한다.