바이러스 패키징에서 빈 캡시드 비율을 낮추는 방법

바이러스 패키징 과정(특히 AAV)에서 빈 캡시드(empty capsid) 비율이 높은 문제는 가장 흔하면서도 실험 결과에 큰 영향을 미치는 요인입니다. 아래에서는 벡터 설계, 패키징 조건, 정제 공정, 품질 평가의 네 가지 측면에서 빈 캡시드 비율을 감소시키는 실질적인 전략을 정리했습니다.

1. 벡터 설계 단계에서 빈 캡시드 발생 최소화 (가장 중요)

1️⃣ 유전자 크기 최적화

• AAV 최적 패키징 크기: 4.4–4.7 kb (ITR 포함)

• 유전자가 너무 짧거나(<3.8 kb)
  패키징 한계에 가까운 경우(>4.9 kb)
  👉 빈 캡시드 비율이 크게 증가

권장 사항

• 불필요한 서열(polyA, WPRE 등) 제거

• 너무 작은 유전자는 중성 spacer 서열 추가

2️⃣ ITR 서열의 완전성 확인

• ITR 결손 또는 돌연변이 → 게놈이 포장되지 않아 빈 캡시드만 생성

• 주요 원인:

  • 대장균 내 재조합

  • ORF만 확인하고 ITR을 검증하지 않음

대응 전략

• ITR 안정 균주(Stbl3 등) 사용

• 상위 공정에서 제한효소(SmaI, BssHII) 분석으로 ITR 검증

2. 패키징 시스템 및 조건 최적화

3️⃣ 3종 플라스미드 비율 조정

AAV 3-플라스미드 시스템:

• Transfer plasmid

• Rep/Cap plasmid

• Helper plasmid

📌 Rep 과발현은 빈 캡시드 증가의 핵심 원인

참고 비율(가이드라인)

• Transfer : Rep/Cap : Helper ≈ 1 : 1 : 2

• 빈 캡시드가 많을 경우 Rep/Cap 비율 감소

4️⃣ 혈청형 선택

• 혈청형에 따라 빈 캡시드 생성 경향 차이 존재

  • AAV2, AAV6: 빈 캡시드 비율이 높은 편

  • AAV8, AAV9: 비교적 게놈 포장 효율 우수

👉 조직 특이성 제약이 없다면 포장 효율이 높은 혈청형 우선 선택

5️⃣ 세포 상태 및 트랜스펙션 품질

• HEK293 세포 상태 불량 → 캡시드는 형성되나 게놈 포장 실패

• 핵심 관리 포인트:

  • 트랜스펙션 시 세포 밀도 70–80%

  • 마이코플라즈마 음성

  • 신선한 PEI 사용 및 비율 일관성 유지

3. 정제 단계에서 빈 캡시드 제거 (결과 차이를 만드는 단계)

6️⃣ 단순 정제 방식만 사용하지 않기

• PEG 침전, 컬럼 정제만으로는
  ❌ 빈 캡시드와 실 캡시드 분리 불가

7️⃣ 밀도 구배 원심분리 적용

권장 방법(연구용)

• 아이오딕사놀 구배(15% / 25% / 40% / 60%)

• CsCl 구배(정확도 높으나 시간 소요)

👉 40% 층에 실 캡시드 농축
👉 상층은 주로 빈 캡시드

4. 품질 평가: 실제로 빈 캡시드가 많은가?

8️⃣ 단일 방법이 아닌 다중 분석 필요

빈 캡시드 감소 =적절한 유전자 크기 + ITR 완전성 + Rep 발현 균형 + 트랜스펙션 최적화 + 밀도 구배 정제