AAV 바이러스 제작 시 빈 캡시드 비율이 높음

AAV 바이러스 제작 과정에서 빈 캡시드(empty capsid) 비율이 높은 현상은 비교적 흔하지만, 감염 효율 저하·실제 유효 용량 감소·in vivo 결과 변동성 증가로 이어질 수 있어 반드시 원인을 점검해야 합니다. 아래에 주요 원인 → 점검 포인트 → 개선 전략을 체계적으로 정리했습니다.

1️⃣ 빈 캡시드가 증가하는 주요 원인

🔹 1. 패키징 플라스미드 불균형

• Cap 단백질 과발현 대비 vector genome 생산 부족

• Rep/Cap 플라스미드 비율이 과도하거나 불안정

📌 결과: 캡시드는 많이 만들어지지만, 내부에 DNA가 채워지지 않음

🔹 2. 벡터 유전자 크기 문제

• AAV 적정 패키징 한계: ~4.7 kb

• 너무 작거나(3 kb 이하) 너무 큰 경우 모두 문제

📌 특히 너무 작은 유전자 → DNA 패키징 효율 저하 → 빈 캡시드 증가

🔹 3. ITR 구조 이상

• ITR 돌연변이, 재조합, 반복 서열 불안정

• E. coli 증식 중 ITR 손상

📌 Rep이 인식하지 못해 genome encapsidation 실패

🔹 4. 세포 상태 및 트랜스펙션 품질

• HEK293 세포 컨디션 불량

• 낮은 트랜스펙션 효율

• 배지 교체 시점 오류

📌 캡시드는 생성되지만 genome 합성이 부족

🔹 5. 수확 타이밍 부적절

• 너무 빠른 수확 → genome 패키징 미완성

• 너무 늦은 수확 → genome 분해

📌 일반적으로 72 h post-transfection 권장 (시스템별 조정 필요)

🔹 6. 혈청형(Serotype) 특성

• AAV2, AAV8 등 일부 혈청형은 구조적으로 빈 캡시드가 많아지는 경향

• 특정 변형 캡시드(mutant capsid)도 영향

2️⃣ 빈 캡시드 비율이 높을 때의 문제점

❌ 실제 기능적 titer(GC/mL) 대비 물리적 titer 과대평가

❌ in vivo 면역 반응 증가

❌ 고용량 투여 필요 → 독성 리스크 증가

❌ 실험 재현성 저하

3️⃣ 개선 전략 & 실험적 해결 방법

✅ 1. 플라스미드 비율 최적화

일반적인 권장 시작점:

Vector : Rep/Cap : Helper = 1 : 1 : 1

→ 이후 Cap 비율 감소 방향으로 미세 조정

✅ 2. 벡터 디자인 최적화

• 총 길이 4.0–4.6 kb 권장

• 너무 짧으면:

  • stuffer sequence 삽입

  • WPRE, intron 추가 고려

✅ 3. ITR 검증 필수

• SmaI / XmaI digestion

• ITR 안정 E. coli strain 사용 (Stbl3 등)

• 반복 freeze–thaw 방지

✅ 4. 생산 조건 개선

• 세포 confluency: 70–80%

• 고품질 endotoxin-free plasmid

• PEI/플라스미드 비율 최적화

✅ 5. 정제 단계에서 빈 캡시드 제거

• CsCl gradient (가장 효과적)

• iodixanol gradient + ion exchange

• Empty/Full 분리 전용 column 사용

4️⃣ 빈 캡시드 비율 분석 방법