AAV 벡터 제작 시 가장 흔한 실패 원인과 해결 전략

AAV 벡터 제작 과정에서 흔히 발생하는 실패 원인과 각각의 해결 전략을 정리하면 아래와 같습니다. 단계별로 세밀하게 살펴보면 문제를 예방하고 생산 효율을 높일 수 있습니다.

1. Plasmid 설계 및 품질 문제

원인:

• 유전자 삽입 시 프레임 오류, 인트론/엑손 불일치

• 제한효소 자국, 반복 서열 등으로 인한 불안정성

• Plasmid DNA 품질 낮음 (오염, 변형, low purity)

해결 전략:

• 코돈 최적화 및 불필요한 반복 서열 제거

• 시퀀싱으로 정확한 서열 검증

• 고순도, Endotoxin-free plasmid 사용

2. 트랜스펙션 효율 저하

원인:

• 세포 상태 불량 (Confluency, 건강하지 않은 HEK293 등)

• 트랜스펙션 시 시약 비율, DNA 양 불균형

• 배양 조건 부적절 (배지, 온도, CO₂ 등)

해결 전략:

• 세포는 70–80% confluent 상태 유지

• 트랜스펙션 시 DNA:reagent 비율 최적화

• 신선한 배지 사용, 스트레스 없는 환경에서 배양

3. AAV 캡시드 및 Rep 발현 문제

원인:

• 3-plasmid 시스템에서 Rep/Cap plasmid 발현 불량

• 캡시드 선택 오류 → 목표 조직/세포와 tropism 불일치

해결 전략:

• Cap 유전자와 serotype 확인

• 발현 벡터 최적화 (Promoter, Kozak 등)

• serotype 선택 시 목표 조직 특이성 확인

4. 바이러스 조립 및 수확 문제

원인:

• 세포 사멸 후 바이러스 수확 시점 미스매치

• 세포 lysis 불완전

• 바이러스 안정성 저하 (pH, 온도)

해결 전략:

• 세포 생존율과 바이러스 발현을 고려한 최적 수확 시점 결정

• 적절한 Lysis buffer 사용

• 저온 보관, 반복 동결/해동 최소화

5. 정제 및 농축 문제

원인:

• 불충분한 불순물 제거 → 낮은 순도

• 원심분리, 필터링 과정에서 바이러스 손실

• PEG precipitation, CsCl gradient 오류

해결 전략:

• 정제 프로토콜 표준화

• 최적화된 농축 방법 사용 (Ultrafiltration, Iodixanol gradient 등)

• 정제 후 QC (qPCR, ELISA, SDS-PAGE 등)로 확인

6. QC/품질검사 실패

원인:

• 벡터 정량, 감염력 확인 미흡

• 오염 미검출 (Mycoplasma, Endotoxin 등)

해결 전략:

• 반드시 titer 측정 (qPCR, ddPCR)

• 감염력 시험 및 조직 특이성 확인

• 오염 테스트 수행