AAV 패키징 시 가장 흔히 발생하는 실수 TOP 10

1️⃣ 플라스미드 품질 문제 (Endotoxin / Supercoiled 비율 낮음)

• 문제점: 엔도톡신 잔존, nicked DNA 비율 높음

• 결과: 세포 독성 증가, 패키징 효율 저하

• 권장: Endo-free grade, supercoiled ≥ 80%

2️⃣ 세포 상태 불량 (과도한 passage / 낮은 viability)

• 문제점: HEK293T 과도한 계대 배양

• 결과: 바이러스 생산량 급감

• 권장: Passage < 20, transfection 시 viability > 90%

3️⃣ 세포 밀도 조절 실패

• 문제점: 과밀 또는 저밀도에서 트랜스펙션

• 결과: 패키징 효율 감소

• 권장: 70–80% confluency에서 transfection

4️⃣ 3-플라스미드 비율 오류 (Transfer : Rep/Cap : Helper)

• 문제점: plasmid ratio 불균형

• 결과: 빈 캡시드 증가, 낮은 유효 바이러스

• 권장: 일반적으로 1 : 1 : 1 (mass 기준)

5️⃣ Transfection Reagent 선택 및 조건 미최적화

• 문제점: PEI/상용 시약 조건 미조정

• 결과: 낮은 transfection efficiency

• 권장: 배치별 PEI 최적화, fresh preparation

6️⃣ Cap 유전자–혈청형 불일치

• 문제점: 실험 목적과 맞지 않는 serotype 선택

• 결과: in vivo 전달 효율 저하

• 권장: 조직 특이성 기반 혈청형 선택

7️⃣ IT R(ITR) 손상 또는 재조합

• 문제점: 반복 서열로 인한 recombination

• 결과: 패키징 불가 또는 낮은 기능성

• 권장: recombination-deficient strain 사용

8️⃣ 수확 시점 오류

• 문제점: 너무 이르거나 늦은 harvest

• 결과: 바이러스 수율 감소

• 권장: transfection 후 60–72 h 수확

9️⃣ 세포 용해 및 바이러스 회수 불완전

• 문제점: freeze–thaw 부족, nuclease 처리 누락

• 결과: 낮은 회수율, 점도 증가

• 권장: 충분한 lysis + Benzonase 처리

🔟 정제·보관 조건 오류

• 문제점: buffer 부적합, 반복 동결해동

• 결과: 바이러스 불활성화

• 권장: PBS + Mg²⁺, aliquot 후 −80 °C 보관