AAV 삼질 플라스미드 공동 트랜스펙션 시스템 (Three-plasmid AAV Packaging System)

AAV 삼질 플라스미드 공동 트랜스펙션 시스템은 현재 가장 널리 사용되는 표준 AAV 벡터 생산 방식으로, 기초 연구 및 동물 실험에 광범위하게 적용되고 있습니다.

1. 삼질 플라스미드 시스템의 구성

① 전달 플라스미드 (Transfer Plasmid)

목적 유전자를 탑재하여 발현을 담당

구성 요소:

• ITR (Inverted Terminal Repeat) ×2

• 프로모터 (CMV, CAG, EF1α, hSyn 등)

• 목적 유전자 (GOI)

• PolyA signal

⚠️ 주의:ITR 사이의 전체 길이는 약 4.7 kb 이하로 유지해야 합니다.

② Rep/Cap 플라스미드 (Packaging Plasmid)

AAV 복제 및 캡시드 형성 담당

• Rep 유전자: AAV 게놈 복제

• Cap 유전자: AAV 혈청형 결정 (AAV2, AAV8, AAV9 등)

👉 Cap 유전자를 변경함으로써 혈청형 전환 가능

③ Helper 플라스미드 (Helper Plasmid)

아데노바이러스 유래 보조 인자 제공

주요 유전자:

• E2A

• E4

• VA RNA

이들 유전자는 AAV 증식에 필수적이지만 AAV 입자에는 포장되지 않아 안전성이 높습니다.

2. 삼질 공동 트랜스펙션 기본 과정

1. HEK293 / HEK293T 세포 배양

2. 삼종 플라스미드 혼합
   (일반적인 질량비: 1 : 1 : 1)

3. PEI 또는 상용 트랜스펙션 시약 사용

4. 트랜스펙션 후 48–72시간 배양

5. 세포 수확 (AAV는 주로 세포 내 존재)

6. 세포 용해 → 바이러스 방출

7. 바이러스 정제 (아이오딕사놀 그라디언트 또는 컬럼)

8. 바이러스 역가 측정 (qPCR / ddPCR)

3. 시스템의 장점

• 아데노바이러스 감염 불필요, 안전성 우수

• 다양한 혈청형 선택 가능

• 재현성 우수, 대량 생산 가능

• GMP 공정과 높은 호환성

4. 주요 문제점 및 주의사항

• 바이러스 역가 낮음:
  트랜스펙션 효율 저하, Rep/Cap 품질 문제, ITR 손상

• 전달 효율 저하:
  혈청형 또는 프로모터 선택 부적절

• 발현 약함/무발현:
  유전자 크기 초과, 모델 부적합