AAV(아데노연관바이러스) 패키징 후 정제 방법

AAV(Adeno-Associated Virus) 바이러스 패키징 후 정제 단계는 최종 바이러스 역가, 순도 및 체내 안전성을 결정하는 핵심 공정이다. 아래에서는 주요 정제 방법, 원리, 장단점 및 적용 시나리오를 중심으로 AAV 정제 방법을 체계적으로 정리하였다.

1. AAV 주요 정제 방법 개요

2. 주요 정제 방법 상세 설명

1️⃣ Iodixanol 밀도 구배 원심분리 ⭐⭐⭐⭐⭐

원리
완전한 AAV 입자(full capsid)와 빈 캡시드(empty capsid)의 밀도 차이를 이용하여 15%–25%–40%–60% 구배에서 분리한다.

공정 개요

• 세포 파쇄(동결–해동 반복 또는 Benzonase 처리)

• Iodixanol 밀도 구배에 시료 적재

• 초고속 원심분리(약 350,000 g, 2–3시간)

• 40% 층에서 바이러스 회수

• 초여과를 통해 Iodixanol 제거 및 완충액 교환

장점
✔ full / empty capsid 분리가 가능
✔ 비용이 비교적 낮고 방법이 성숙됨
✔ 연구실 규모 실험에 적합

단점
✖ 숙련도에 따라 결과 편차 발생
✖ 대량 생산에 부적합
✖ 숙주 단백질 및 DNA 제거 한계 존재

적용 분야
👉 기초 연구, 소규모 체내·체외 실험

2️⃣ 염화세슘(CsCl) 밀도 구배 ⭐⭐

특징

• full / empty capsid 분리 해상도 매우 우수

• 공정 시간이 길음(24–48시간)

• CsCl 자체 독성으로 인해 바이러스 활성이 저하될 수 있음

현황
⚠️ 현재는 대부분 비권장되며, 특수한 기전 연구에서만 제한적으로 사용됨

3️⃣ 컬럼 크로마토그래피 정제 ⭐⭐⭐⭐

주요 유형

• AVB Sepharose(친화 크로마토그래피)

• 이온교환 크로마토그래피(IEX)

• 겔 여과 크로마토그래피(SEC, 폴리싱 단계)

대표 공정
세포 파쇄 → 여과 → 친화 컬럼 포집 → 용출 → IEX 정제 → 초여과/완충액 교환

장점
✔ 높은 순도와 우수한 배치 간 일관성
✔ 대량 생산 및 GMP 공정 적용 가능
✔ 숙주 단백질 및 DNA 제거 능력 우수

단점
✖ 비용이 높음
✖ 혈청형에 따라 결합 효율 차이 존재(AAV5 등)

적용 분야
👉 전임상 연구, IND, GMP 생산

4️⃣ PEG 침전 + 컬럼 정제 ⭐⭐⭐

원리
PEG를 이용해 대용량 상등액에서 AAV를 농축한 후, 컬럼 크로마토그래피로 추가 정제

장점
✔ 대용량 처리 가능
✔ 회수율이 높음
✔ 비용 효율적

단점
✖ 최종 순도는 후속 공정에 의존
✖ PEG 잔존물 관리 필요

5️⃣ 초여과(UF / TFF / Amicon) — 보조 공정

주요 목적

• 바이러스 농축

• 완충액 교환(PBS, DPBS, Pluronic F68 등)

⚠️ 일반적으로 단독 정제 방법으로는 사용하지 않음

3. 적용 시나리오별 추천 정제 전략

4. 정제 후 필수 품질 분석(QC)

• 바이러스 역가(qPCR / ddPCR)

• Empty capsid 비율(AUC / TEM / ELISA)

• 숙주 DNA 잔류량

• 숙주 단백질(HCP) 잔류량

• 엔도톡신(LAL)

• 무균 시험 / 마이코플라스마 검사

5. 자주 발생하는 문제 및 원인

⚠️ 정제 후 역가 감소
→ 회수 층 선택 오류 / 과도한 초여과 / empty capsid 비율 증가

⚠️ 체내 독성 또는 염증 반응
→ 숙주 단백질, DNA, 엔도톡신 제거 불충분

⚠️ 혈청형별 회수율 차이
→ 혈청형 특성에 따른 정제 공정 최적화 필요