렌티바이러스 벡터(Lentiviral vector) 구축 실패 원인

1. 플라스미드 설계 및 구축 문제

①삽입 서열 문제

• 목표 서열이 너무 길거나 구조가 복잡하면 벡터 안정성에 영향.
• 반복 서열이나 GC 함량이 높으면 2차 구조 형성으로 클로닝 효율 저하.
• 바이러스 민감 부위(LTR 반복 서열 등)가 포함되면 재조합이나 손실 발생 가능.

②벡터 자체 설계 문제

• 벡터 플라스미드 불완전 또는 오염(핵산 분해, 돌연변이 등).
• 프로모터, 마커 유전자, shRNA 등 요소 조합이 부적절하면 패키징 영향.

③제한효소 절단 및 연결 문제

• 절단 불완전 또는 연결 방향 오류 시 구축 실패.
• 삽입 서열과 벡터가 맞지 않거나 적절한 어댑터 서열 미사용.

2. 숙주 세포 또는 형질전환 문제

①형질전환 효율 저하

• 세포 감수성 낮거나 오래 보관, 취급 부적절 시 형질전환 효율 저하.
• 큰 벡터(예: 렌티바이러스 벡터)는 일반 대장균에서 효율 낮음 → 고효율 세포주(Stbl3 등) 사용 권장.

②세포 스트레스 또는 세포사

• 열, 독소, 보관 문제 등으로 세포가 죽으면 클론 확보 실패.

3. 바이러스 패키징 및 발현 문제

①보조 플라스미드 문제

• 3플라스미드/4플라스미드 시스템에서 비율 불균형.
• 패키징 플라스미드 돌연변이 또는 분해 시 바이러스 조립/감염 불가.

②바이러스 독성

• 특정 유전자가 숙주 세포에 독성 → 발현 억제 또는 세포사 발생.

③바이러스 수율 저하

• 낮은 역가 바이러스 → 검출/선별 시 ‘구축 실패’처럼 보일 수 있음.

4. 실험 환경 및 조작 문제

①오염

• 세균, 진균, 마이코플라즈마 오염 → 클로닝/플라스미드 증폭 영향.

②조작 실수

• 버퍼, 효소, 온도 잘못 사용, 순서 오류.
• PCR 과정에서 돌연변이 또는 비특이적 증폭 발생.

점검 권장 사항

• 서열 검증: 삽입 서열과 벡터 정확성 시퀀싱 확인.

• 소형 조각 우선 검증: 짧은 조각 먼저 클로닝 테스트.

• 세포 및 균주 최적화: 고효율 감수성 균주 또는 안정 숙주 세포 사용.

• 플라스미드 품질 점검: 분해 없이 순도 높은 플라스미드 사용.

• 독성 유전자 주의: 표적 유전자 독성 있을 경우 유도형 프로모터 사용 또는 비발현 벡터로 구축.