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AAV 사용 중 흔한 문제 요약

Nov 10 , 2025
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① AAV 패키징(포장) 단계의 일반적인 문제

문제 가능한 원인 해결 방법
1. 바이러스 역가가 낮음 – 형질감염 효율이 낮음 (세포 상태 불량, 플라스미드 비율 부적절) – 세포 밀도 및 형질감염 조건 최적화
– 플라스미드 순도 부족 또는 내독소 오염 – 내독소 제거형 고순도 플라스미드 사용
– 포장 세포 밀도가 최적이 아님 (HEK293T 70–80% 융합 미만) – 혈청형과 벡터의 호환성 확인
– Rep/Cap 또는 보조 플라스미드 불일치 – 수확 시점을 72–96시간으로 조정
2. 세포 사멸률이 높음 – 형질감염 시 과도한 DNA 또는 시약 사용 – DNA 및 형질감염 시약 양 조절
– 내독소 수준이 높음 – 고순도 플라스미드 사용
– 배양 환경 이상 – CO₂ 및 배양 온도 확인
3. 상등액 오염이 심함 – 무균 조작 미흡 – 무균 조작 강화
– 여과 단계 불완전 – 0.22 μm 필터로 여과 후 정제 진행

② AAV 정제 및 농축 단계의 문제

문제 가능한 원인 해결 방법
1. 바이러스 회수율이 낮음 – PEG 침전 또는 밀도구배 원심 조건 부적절 – PEG 농도, pH, 원심 조건 최적화
– 필터 흡착 손실 – 저흡착 필터(PVDF) 사용
– 동결-해동 반복으로 인한 불활성화 – 반복 동결-해동 피함
2. 바이러스 용액이 혼탁하거나 응집됨 – 단백질, DNA 불순물 잔존 – Tween-20(0.001–0.01%) 소량 첨가
– 고농도 AAV 자가 응집 – 농축 비율 조절
– 4°C 단기 / -80°C 장기 보관
3. 역가 측정 결과 불안정 – qPCR 프라이머 설계 불량 – 프라이머 및 표준물질 최적화
– 표준 플라스미드 정확도 부족 – 선형화된 표준 플라스미드 사용
– 시료 추출 방법 통일

③ AAV 감염 및 형질도입(전달) 단계의 문제

문제 가능한 원인 해결 방법
1. 감염 후 형광 또는 발현이 없음 – 세포가 해당 혈청형에 비적합 (수용체 불일치) – 적절한 혈청형 선택 (예: AAV2, AAV9 등)
– MOI 또는 역가 부족 – 감염량 또는 감염 횟수 증가
– 프로모터 활성 저조 – 세포 특이적 강한 프로모터 사용
2. 감염 효율이 낮음 – 세포외기질(ECM)이 AAV 접근 차단 – Poly-L-Lysine 등 코팅제 사용
– 감염 시간 미흡 – 감염 시간 24–48시간으로 연장
3. 동물실험에서 발현이 약함 – 혈청형과 조직 특이성이 불일치 – 목표 조직에 맞는 혈청형 선택 (예: AAV8/9-간, AAV-PHP.eB-중추신경)
– 주사 경로 부적절 – 주입 경로 최적화 (정맥, 근육, 뇌실 등)
– 면역 반응에 의한 제거 – 단기 면역억제 병행 가능 (예: 스테로이드 단기 사용)

④ 보관 및 사용상의 문제

문제 가능한 원인 해결 방법
1. 바이러스 활성 감소 – 반복 동결-해동 – 소분하여 -80°C 보관
– 저장 온도 부적절 – Pluronic F-68(0.001%) 포함 PBS 또는 Tris 버퍼 사용
– 완충액 조성 불량
2. 장기 보관 후 오염 발생 – 무균 관리 미흡 – 항생제(예: 0.05% penicillin-streptomycin) 소량 첨가
– 튜브 개폐 반복 – 철저한 무균 조작 수행

⑤ 실험 설계 시 자주 발생하는 실수

  • ⚠️ 벡터 용량 초과: AAV의 포장 한계는 약 4.7 kb (ITR 포함). 초과 시 역가 급감.

  • ⚠️ ssAAV / scAAV 구분 누락: scAAV는 발현 속도 빠르나 용량 절반으로 감소.

  • ⚠️ 혈청형 및 프로모터 선택 오류: 세포 및 조직 특이성 차이 큼.

  • ⚠️ 공캡시드(Empty Capsid) 비율 무시: 기능성 입자 비율 저하로 실험 결과 왜곡 가능.

About PackGene

PackGene Biotech is a world-leading CRO and CDMO, excelling in AAV vectors, mRNA, plasmid DNA, and lentiviral vector solutions. Our comprehensive offerings span from vector design and construction to AAV, lentivirus, and mRNA services. With a sharp focus on early-stage drug discovery, preclinical development, and cell and gene therapy trials, we deliver cost-effective, dependable, and scalable production solutions. Leveraging our groundbreaking π-alpha 293 AAV high-yield platform, we amplify AAV production by up to 10-fold, yielding up to 1e+17vg per batch to meet diverse commercial and clinical project needs. Moreover, our tailored mRNA and LNP products and services cater to every stage of drug and vaccine development, from research to GMP production, providing a seamless, end-to-end solution.

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