AAV(아데노연관바이러스, Adeno-Associated Virus)에 감염된 세포에서 녹색 형광(GFP 등) 이 약하게 나타나는 것은, 주로 바이러스의 전이 효율, 세포 상태, 또는 유전자 발현 조절 문제 때문입니다.
1. 바이러스 자체 요인
| 원인 | 설명 | 개선 방안 |
|---|---|---|
| ① 바이러스 역가(titer)가 낮음 | 감염에 사용한 바이러스 입자 수가 부족하면, 세포 내로 들어가는 유전자 복제체 수가 적어 형광 신호가 약함. | 감염 시 MOI(감염다중성) 를 높이거나, qPCR을 통해 바이러스 역가를 다시 확인. |
| ② 바이러스 불활성화 또는 품질 저하 | 반복적인 동결·해동, 장기 보관, 오염 등으로 감염력이 떨어짐. | -80°C에서 보관하고, 동결-해동은 1회 이하로 제한. |
| ③ 혈청형과 세포의 비적합성 | AAV의 혈청형(serotype) 은 세포 수용체와의 결합 능력을 결정함. 특정 혈청형은 특정 세포에서 효율이 매우 낮음. | 세포에 맞는 혈청형 선택 (예: AAV2 – 신경계, AAV6 – 근육, AAV9 – 신경·심장 등). |
| ④ 벡터 구성 문제 | GFP 유전자의 프레임 오류, ITR 손상, 약한 프로모터, 삽입 방향 오류 등이 있으면 발현이 떨어짐. | 플라스미드 서열 재확인, 프로모터와 유전자 연결부 점검. |
2. 세포 관련 요인
| 원인 | 설명 | 개선 방안 |
|---|---|---|
| ⑤ 세포 표면 수용체 부족 | AAV는 혈청형에 따라 특정 수용체(HSPG, sialic acid 등)에 의존함. 세포에 해당 수용체가 적으면 감염 효율이 낮음. | 다른 혈청형 사용 또는 세포 전처리(예: 폴리브렌 처리) 시도. |
| ⑥ 세포 분열 상태 | AAV는 주로 비분열 세포에서 안정적으로 발현됨. 세포가 활발히 분열하면 바이러스 게놈이 희석되어 형광 약화. | 세포를 안정된 상태로 유지(분화 세포 또는 성장 정체기 사용). |
| ⑦ 세포 건강 상태 불량 | 오염, 과도한 계대, 스트레스 등은 감염 및 발현 효율 저하. | 건강한 대수기 세포 사용, 세포 스트레스 최소화. |
3. 실험 조건 요인
| 원인 | 설명 | 개선 방안 |
| ⑧ 감염 후 발현 시간 부족 | AAV는 세포 내에서 단일가닥 DNA를 이중가닥으로 전환해야 하므로, 발현까지 시간이 걸림(48~72시간 이상 필요). | 감염 후 3~5일 동안 관찰. |
| ⑨ 프로모터 활성 저하 | CMV 등 일부 프로모터는 특정 세포에서 메틸화나 침묵(silencing) 으로 인해 발현이 약해질 수 있음. | 세포에 맞는 프로모터 사용 (예: CAG, EF1α, Synapsin 등). |
| ⑩ 형광 관찰 조건 부적절 | 현미경의 노출 시간, 필터 설정, 형광 휘도 저하 등 기술적 문제. | 노출 시간 조정, 형광검출기 점검, 또는 유세포분석기로 정량 확인. |
4. 실제 연구자 팁
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감염 후 24시간에는 형광이 약하거나 거의 안 보일 수 있음 → 48~72시간 이후 관찰.
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동일 조건에서 양성 대조군 (예: 고효율 혈청형, 다른 프로모터)을 함께 사용하면 문제 원인 구분에 도움.
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형광이 점차 사라지는 경우 → 세포 분열에 의한 비유전적 손실 가능성.
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