AAV 바이러스 패키징 FAQ (자주 묻는 질문)

Ⅰ. 기본 원리 및 시스템 구성

Q1: AAV 패키징이란 무엇인가요?

AAV(아데노연관바이러스) 패키징은 재조합 AAV 벡터를 생산하기 위해 필요한 보조 유전자를 포장 세포에 일시적으로 발현시켜, 목적 유전자를 포함한 AAV 입자를 형성하는 과정입니다.

Q2: AAV의 기본 구조는 어떻게 되나요?

AAV는 단일 가닥 DNA 바이러스이며, rep(복제 관련)과 cap(캡시드 단백질) 유전자를 가지고 있습니다.
패키징 시에는 이 두 유전자를 보조 플라스미드로 공급하고, 목적 유전자는 ITR(역전반복서열) 사이에 삽입됩니다.

Q3: AAV는 어떻게 복제되나요?

AAV는 단독으로 복제할 수 없으며, 보조 바이러스(예: 아데노바이러스) 또는 이에 대응하는 헬퍼 유전자가 필요합니다.
패키징 과정에서는 보조 인자 기능을 다른 플라스미드로 대체하여 재조합 바이러스를 생산합니다.

Q4: AAV 패키징에 사용되는 주요 플라스미드는 몇 개인가요?

일반적으로 3플라스미드 시스템을 사용합니다.

1. Transfer plasmid: ITR 사이에 목적 유전자 삽입

2. Rep/Cap plasmid: 바이러스 복제 및 캡시드 단백질 제공

3. Helper plasmid: 아데노바이러스 유전자(E2A, E4, VA RNA 등) 제공

Q5: 2-플라스미드 시스템이란 무엇인가요?

Rep/Cap과 Helper 유전자를 하나의 플라스미드에 결합하여 두 개의 플라스미드만으로 패키징하는 방식으로, 효율은 높지만 유연성은 낮습니다.

Ⅱ. 세포 선택 및 배양 조건

Q6: AAV 패키징에 주로 사용하는 세포는?

HEK293T 세포가 가장 널리 사용됩니다. 이 세포는 아데노바이러스 E1 유전자를 발현하여 AAV 보조 인자 기능을 지원합니다.

Q7: 세포 상태가 패키징 효율에 미치는 영향은?

매우 큽니다.

• 세포 밀도는 약 70–90% confluence가 이상적입니다.

• 과도하게 증식하거나 노화된 세포는 낮은 역가를 초래합니다.

• 오염이 없어야 하며, 배양액은 신선해야 합니다.

Q8: 배양 조건은 어떻게 설정하나요?

DMEM + 10% FBS, 항생제 없이 37°C, 5% CO₂ 조건에서 배양합니다.
패키징 후 배지를 자주 교환하면 바이러스 형성이 저하될 수 있습니다.

Ⅲ. 트랜스펙션 및 바이러스 수집

Q9: 트랜스펙션 방법은?

주로 PEI, Lipofectamine, CaCl₂ 인산염법 등을 사용합니다.
PEI는 비용 효율적이고 대량 생산에 적합합니다.

Q10: 플라스미드 혼합 비율은 어떻게 되나요?
예시 (3-플라스미드 시스템):

• Transfer : Rep/Cap : Helper = 1 : 1 : 1 (질량 기준)
  하지만 세포 상태에 따라 약간 조정할 수 있습니다.

Q11: 바이러스 수집 시점은 언제인가요?

• 첫 번째 수집: 트랜스펙션 후 48시간

• 두 번째 수집: 72시간

• 수집 후 상층액은 0.45 μm 필터로 여과합니

Ⅳ. 정제 및 역가 측정

Q12: AAV 정제 방법은 어떤 것이 있나요?

• 아이오딕세놀(iodixanol) 밀도구배 원심분리

• CsCl 밀도구배법

• Affinity chromatography (AVB column 등)
  실험 규모에 따라 선택합니다.

Q13: 역가 측정 방법은 무엇인가요?

1. qPCR: ITR 또는 transgene 서열을 타깃으로 정량 → genome titer (vg/mL)

2. ELISA: 캡시드 단백질(AAV capsid) 정량

3. Dot blot / Southern blot: 구형 바이러스 입자 검출

4. Infectious titer assay: 실제 감염 능력 측정

Q14: vg/mL 값은 실제 감염력과 동일한가요?

아닙니다. vg/mL은 바이러스 입자 수를 나타내며, 실제 감염 가능한 입자의 비율은 그보다 낮습니다. (보통 10~50%)

Ⅴ. 흔한 문제 및 트러블슈팅

Q15: AAV 역가가 낮은 이유는 무엇인가요?

가능 원인:

• 트랜스펙션 효율 저조

• 세포 상태 불량 (과밀, 영양 부족)

• 플라스미드 비율 부적절

• 수집 시점이 너무 빠르거나 늦음

• Rep/Cap 벡터의 serotype 발현 문제

Q16: 정제 후 바이러스 회수율이 낮아요.

가능 원인:

• 밀도구배층 분리 부정확

• 농축 중 손실 (필터 흡착, 단백질 응집)

• 샘플 과희석

Q17: 감염 후 목적 유전자 발현이 약합니다.

가능 원인:

• 프로모터 약함

• 세포형 특이적 발현 제한

• AAV 혈청형(serotype)이 세포에 적합하지 않음

Q18: 바이러스가 뭉치거나 침전이 생깁니다.

AAV는 고농도에서 입자 간 응집이 일어날 수 있습니다.

• 0.001% Pluronic F-68 첨가

• pH 안정화 (PBS pH 7.4)

• 저속 냉장 보관 권장

Q19: AAV 보관 조건은?

• 단기(1주 이내): 4°C

• 장기: –80°C에서 소분 보관

• 반복 동결-해동 금지 (활성 급감)

Ⅵ. 효율 향상 팁

• 고순도, 내독소 제거 플라스미드 사용

• 트랜스펙션 전 신선한 배지로 교체

• 항생제 사용 최소화

• 수집 시 세포 잔여물 제거 (필터 사용)

• 필요 시 AAV capsid serotype 최적화 (AAV2, AAV8, AAV9 등)

Ⅶ. 참고

• AAV는 세포 내에서 복제할 수 없으며, 패키징 과정에서만 형성됩니다.

• 혈청형(serotype)은 조직 특이성(tropism)을 결정하므로 목적에 맞게 선택해야 합니다.

• 고품질 플라스미드와 최적 세포 상태가 가장 중요한 성공 요인입니다.