렌티바이러스 패키징 FAQ (자주 묻는 질문)

Ⅰ. 기본 원리 및 시스템 구성

Q1: 렌티바이러스 패키징이란 무엇인가요?

렌티바이러스 패키징은 보조 플라스미드 시스템을 이용하여 포장 세포 내에서 바이러스 구조 단백질과 복제 관련 단백질을 일시적으로 발현시켜, 목적 유전자를 포함한 전달 플라스미드(transfer plasmid)를 감염 가능한 바이러스 입자로 포장하는 과정입니다.

Q2: 렌티바이러스와 레트로바이러스의 관계는 무엇인가요?

렌티바이러스는 레트로바이러스(Retroviridae)과의 한 속(Lentivirus)에 속하며, 분열 세포뿐 아니라 비분열 세포도 감염할 수 있는 특징이 있습니다.

Q3: 흔히 사용되는 렌티바이러스 패키징 시스템은?

• 3-플라스미드 시스템: transfer plasmid + packaging plasmid(gag/pol/rev/tat) + envelope plasmid(VSV-G)

• 4-플라스미드 시스템: gag/pol, rev, tat, env를 각각 분리하여 안정성과 생물안전성을 높인 시스템

Q4: 각 플라스미드의 역할은 무엇인가요?

• Transfer plasmid: 목적 유전자와 LTR, ψ 신호를 포함

• Packaging plasmid: 바이러스의 핵심 단백질(Gag, Pol, Rev, Tat)을 제공

• Envelope plasmid: 외피 단백질(VSV-G 등)을 제공하며, 숙주 범위를 결정

Q5: 렌티바이러스 시스템의 생물안전 등급은?

3세대 혹은 4세대 시스템은 복제 결핍형(self-inactivating, SIN)으로, BSL-2 수준의 안전 환경에서 다뤄야 합니다.

Ⅱ. 세포 선택 및 배양 조건

Q6: 흔히 사용하는 패키징 세포는 무엇인가요?

HEK293T (또는 293FT) 세포가 가장 널리 사용됩니다. T antigen 발현으로 플라스미드 복제가 강화되어 높은 전이(transfection) 효율을 보입니다.

Q7: 세포 상태가 패키징 효율에 미치는 영향은?

매우 큽니다.

• 건강하고 오염이 없는 세포 사용

• 접종 밀도: 70–90% confluence

• 세포 세대수: 30세대 이하 권장

Q8: 배지와 혈청 조건은?

일반적으로 DMEM + 10% FBS, 항생제는 사용하지 않는 것이 좋습니다. 배양 중 혈청 농도 급변은 피해야 합니다.

Ⅲ. 전이(Transfection) 및 바이러스 수집

Q9: 어떤 전이 방법이 주로 사용되나요?

• 화학적 방법: PEI, Lipofectamine, Calcium phosphate

• 물리적 방법: 전기천공법(일반적으로 잘 사용하지 않음)

Q10: 바이러스 수집 시점은 언제인가요?

• 첫 번째 수집: 전이 후 48시간

• 두 번째 수집: 전이 후 72시간 (필요 시 추가 수집 가능)

Q11: 바이러스 농축이 필요한가요?

 높은 감염력이 필요한 경우 초원심분리, PEG 침전.

Ⅳ. 바이러스 역가(titer) 측정

Q12: 렌티바이러스 역가 측정 방법은?

1. 기능적 역가 (IFU 또는 TU/mL): 표적 세포 감염 후 형광 또는 내성 유전자 발현으로 측정

2. 유전체 역가 (vg/mL): qPCR로 검출

3. p24 ELISA: 바이러스 캡시드 단백질 함량으로 간접 측정

Q13: 기능적 역가와 물리적 역가의 차이는?

기능적 역가는 실제 감염 능력을 나타내며, 물리적 역가는 바이러스 입자 수를 의미합니다. 두 값은 반드시 일치하지 않습니다.

Ⅴ. 흔한 문제 및 트러블슈팅

Q14: 감염 후 형광 신호가 보이지 않아요.

가능 원인:

• 목적 유전자 또는 프로모터 불활성

• 역가가 너무 낮음

• 표적 세포 감수성 낮음

• 감염 조건 부적절 (MOI 낮거나 시간 부족)

• 항생제 농도 부적절

Q15: 패키징 효율이 낮거나 역가가 낮은 경우

확인 항목:

• 플라스미드 비율 불균형

• 전이 효율 낮음 (DNA 순도, PEI 품질, 세포 상태 등)

• 세포 밀도 과다/부족

• 배지나 FBS 품질 문제

• 수집 시점 부적절

Q16: 수집한 바이러스 오염 혹은 활성 손실

가능 원인:

• 세균 오염 또는 필터 막힘

• 반복적인 동결-해동

• 부적절한 저장 (–80°C 보관 필요, 소분 필수)

Q17: 감염은 잘되지만 세포가 많이 죽어요.

가능 원인:

• VSV-G 외피 단백질의 세포 독성

• 높은 MOI로 인한 세포 스트레스

• 목적 유전자의 세포 독성

Q18: 농축 후 침전물이 생겨요.

가능 원인:

• PEG 과량 사용

• 용해 불충분

• 저온에서 단백질 응집 발생

Q19: 장기 저장 후 감염력이 감소했어요.

렌티바이러스는 –80°C에서 수개월 안정하지만, 2회 이상 동결-해동 시 감염력 급감하므로 소량으로 나누어 보관하는 것이 좋습니다.

Ⅵ. 효율 향상 팁

• 내독소 제거 플라스미드 사용

• 전이 전 신선한 배지 교환

• 항생제 사용 최소화

• 상층액은 수집 시 필터로 세포 잔해 제거

• 고역가 필요 시 초원심분리 또는 농축 시도