AAV 바이러스 감염에서는 GFP 형광이 보이지 않습니다.

다음은 가능한 원인과 해결 방안을 체계적으로 정리한 것입니다.

1. 감염 자체의 문제 (Transduction Failure)

GFP가 보이지 않는 가장 근본적인 이유는 AAV 바이러스가 세포에 성공적으로 감염되지 않았거나, 감염되었더라도 유전자 발현이 일어나지 않았기 때문입니다.

• 바이러스 역가(Titer) 문제:

  • 원인: 바이러스 stock의 실제 역가가 생각보다 낮을 수 있습니다. 제조사에서 표기한 역가와 실제 역가가 다를 수 있으며, 동결보관/해동 과정에서 역가가 떨어졌을 수 있습니다.

  • 해결: MOI(Multiplicity of Infection) 를 높여서 실험해 보세요. (예: MOI 10,000 → 50,000 → 100,000 vg/cell) Positive control로 사용이 확인된 AAV를 동일한 조건에서 처리해 비교하는 것이 가장 좋은 방법입니다.

• 감염 조건 문제:

  • 세포 종류: AAV는 세포 종류에 따라 감염 효율이 천차만별입니다. 사용하시는 세포주가 해당 AAV Serotype 에 대해 감수성이 있는지 문헌을 확인해 보세요. (예: AAV2, AAV5, AAV6, AAV9 등은 선호하는 세포/조직이 다릅니다.)

  • 감염 방법: 바이러스를 처리할 때 사용하는 배지(예: 혈청 유무), 감염 보조제(예: Polybrene) 사용 여부, 감염 후 배지 교환 시간 등이 효율에 영향을 미칩니다.

2. 유전자 발현의 문제 (Expression Failure)

감염은 되었지만 GFP 유전자가 제대로 발현되지 않는 경우입니다.

• 프로모터(Promoter) 문제:

  • 원인: GFP 유전자 앞에 있는 프로모터가 사용하시는 세포 종류에서 작동하지 않을 수 있습니다. (예: CAG 프로모터는 대부분의 세포에서 강력하게 작동하지만, 특정 세포 특이적 프로모터는 해당 세포에서만 작동합니다.)

  • 해결: 강력하고 범용적인 프로모터(예: CMV, CAG, EF1α)를 사용한 AAV를 테스트해 보세요.

• 발현 시점 문제:

  • 원인: AAV는 감염 후 유전자 발현까지 시간이 상대적으로 오래 걸립니다. ssAAV(Single-stranded AAV)의 경우 2차 가닥 합성이 필요하여 발현이 늦어지고(수일~1주), scAAV(self-complementary AAV)는 더 빠른 발현(수일)을 보입니다.

  • 해결: 감염 후 충분한 시간(최소 48-72시간, 경우에 따라 1주 이상) 이 지났는지 확인하세요. 시간 경과에 따른 형광 변화를 관찰해 보세요.

3. 검출의 문제 (Detection Failure)

GFP가 발현되었지만, 우리가 관찰하지 못하는 경우입니다.

• 현미경 설정 문제:

  • 원인: 형광 현미경의 필터 세트가 GFP에 맞지 않거나, 광원(램프/LED)이 약하거나, 노출 시간이 너무 짧을 수 있습니다.

  • 해결: Positive control (GFP가 발현되는 것으로 알려진 세포 또는 샘플)을 같은 조건에서 관찰하여 현미경 설정이 정상적인지 확인하세요. GFP에 맞는 여기/방사 필터를 사용하고, 노출 시간을 점차 늘려가며 확인해 보세요.

• 시료 처리 문제:

  • 원인: 고정(Formalin, PFA 등) 과정에서 GFP 형광이 소실되거나 약해질 수 있습니다.

  • 해결: 가능하다면 생세포(Live cell) 상태에서 형광을 관찰해 보세요. 고정이 필수적이라면, GFP 형광을 잘 보존하는 고정 방법(예: 4% PFA, 단시간 고정)을 사용하세요.

• 발현 수준 문제:

  • 원인: GFP 발현 수준이 현미경으로 검출하기에 너무 낮을 수 있습니다.

  • 해결: 항체를 이용한 면역염색 (Immunostaining)을 통해 GFP 단백질을 간접적으로 증폭하여 검출해 보세요. 이 방법은 GFP 발현을 훨씬 민감하게 확인할 수 있는 좋은 대체 방법입니다.

4. 바이러스 자체의 문제 (Virus Quality Problem)

• 원인: 바이러스 자체가 제대로 제조되지 않았거나, 운송 및 보관 중에 변성되었을 수 있습니다. 동결-해동을 반복하면 역가가 급격히 떨어집니다.

• 해결: 가능하다면 새로운 batch의 바이러스를 구매하거나, 다른 구조의 AAV (예: GFP 유전자의 위치가 다른 것)로 테스트해 보세요. 바이러스는 Aliquot하여 -80°C에 보관하고, 해동 후에는 바로 사용하며 재동결을 피하세요.

문제 해결을 위한 체크리스트

1. Positive Control 확인: 다른 AAV로 같은 세포에서 형광이 관찰되는가?

2. 현미경 확인: 다른 GFP 샘플로 현미경 설정이 정상적인가?

3. 시간 확인: 감연 후 충분한 시간(72시간 이상)이 지났는가?

4. MOI 확인: MOI를 높여서 실험해 보았는가?

5. 세포 확인: 사용한 세포주가 해당 AAV serotype에 적합한가?